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TH基因修饰骨髓基质细胞源神经干细胞自体移植治疗恒河猴帕金森病模型

徐强  
【摘要】:一.概述 帕金森病是1817年英国医生James Parkinson描述的,以运动困难、肌肉强直、静止性震颤为特征的锥体外系疾病。多在50~65岁起病,呈进行性缓慢病程,主要病理变化是黑质纹状体区的多巴胺能神经元的变性、缺失,导致脑内多巴胺能神经递质相对减少,但其病因和发病机制尚不十分明确。目前,药物治疗、各种外科治疗(核团损毁术和DBS)只限于症状控制,并不能阻止帕金森病患者的病程进展。随着神经干细胞、分子克隆和重组基因技术的逐渐成熟,使神经干细胞基因治疗帕金森病的前景更加光明。 目前,PD基因治疗研究主要有两个方向:一是脑内导入酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因,通过TH基因的有效表达,提高脑内DA水平,以缓解PD症状;或导入各种神经营养因子或抗凋亡基因(bcl-2)、抗氧化基因(CuZnSOD和MnSOD),改善黑质-纹状体的微环境,保护DA能神经元。二是联合基因治疗,即脑内导入两种以上的目的基因,希望同时达到上述目的。基因治疗的方法主要有:①体内直接转染法:把携带有治疗基因的载体(非病毒、病毒)直接注入到纹状体区,通过与周围细胞的粘附、吞饮、渗透、进入细胞内并与细胞内的染色体整合,或独自表达,表达产物的释放,起到生物药物泵的作用,发挥治疗作用,此方法简便、直接,但转染率低,易受到体内溶酶体中核酸酶的降解,靶向性差,基因表达程度低,可控性差,无法进行筛选和鉴定。②体外细胞介导法:体外细胞介导基因治疗结合基因转移技术和 弟一军医大学二零零一级博士学位论文导师:徐如祥教授 脑内移植,可以在体外通过分子和生物化学技术对基因表达进行评估, 首先是通过载体把目的基因转入到培养的靶细胞内,在体外进行筛选、 鉴定,再进行扩增,然后移植于靶位点,转基因的表达功能通过生化技 术和实验动物行为进行评估和监测。 帕金森病基因治疗的靶细胞有成纤维细胞,原代骨骼肌细胞、胶质 细胞、胚胎中脑细胞、神经干细胞等。重组成纤维细胞、原代骨骼肌细 胞虽然易于培养,能够发挥一定的治疗作用,但在脑内成活时间短、成 活率低,不能与宿主细胞产生突触联系;胚胎中脑细胞、胚胎神经干细 胞、成体神经干细胞存在非自体来源和来源有限的问题,限制了在帕金 森病基因治疗上的应用。由于骨髓基质细胞容易获取,可以在体外大量扩 增,而且可在一定条件下诱导成神经细胞并运用于自体移植,这为神经 干细胞的应用提供了无限制的来源。骨髓源神经干细胞(NSCs一BMSCS) 的开发和应用,克服了从脑组织获取神经干细胞的危险性和局限性,也 避免了胎儿组织移植中存在的伦理、免疫排斥、来源有限等问题。以骨 髓源神经干细胞为载体,进行基因转染、定向诱导神经干细胞为DA能 神经元,替代变性的多巴胺能神经元,同时,神经干细胞分泌的神经营 养因子则可以改善局部的微环境,起着营养支持的作用,从而可根本上 遏制帕金森病的渐进病程。 本研究采用分子克隆、骨髓源神经干细胞培养和脑立体定向细胞移 植等实验技术,将hTH基因分别构建入pEGFP一cZ和peDNA3.IHis真 核表达载体中,构建了pEGFP一cZ一hTH和PcDNA3.IHis一hTH。同时, 纯化提取pEGFP一cZ质粒,酶切鉴定后分别转入培养的骨髓源性神经干 细胞,体外进行其基因表达情况的观察,证实成功表达后,将转染的骨 髓源性神经干细胞定向注射入经右颈总动脉注射MPTP制作的偏侧恒河 猴帕金森病模型的尾状核头部和黑质部位。移植后定期观察恒河猴的动 作行为变化。5个月后行头部’“F一FDG PET、MRI和”9mrI’c一TRoDAf一l SPECT检查,分别观察细胞移植后脑内的代谢、结构和脑内DA能神经 元的分布。最后,免疫组织化学观察移植细胞的分布情况。 第7页 第一军医大学二零零一级博士学位论文导师:徐条祥教授 二.本实验的主要方法和结果: 1.为适时观察基因在细胞内的表达,以户从VZ一TH为模板,PcR扩增 ,携带Eco班和BamHI双酶切位点的hTH目的片段,大小为1,500bp。 回收PcR产物与与pEGFP一cZ的双酶切片段连接,连接产物转化感 受态BL21,卡那霉素抗性筛选阳性克隆。提取质粒经酶切和测序鉴 定,结果显示:hTH目的片段测序结果与报道序列(gi:37 1 26)同源 性达100%;pEGFP一cZ一hTH酶切片段大小正确,说明已成功地将 hTH基因克隆到荧光表达载体pEGFP一cZ上。pEGFP一cZ为真核荧 光表达载体,5’端连接有报告基因即增强绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)基因,EGFP在紫外光激发下可发强 绿色荧光,能较好的标示出细胞转染情况。 2.为移植后跟踪移植细胞的迁移分布情况,以p认钱VZ一TH为模板,PCR 扩增携带KPul和xbal双酶切位点的hTH目的片段,大小为1,500bp。 回收peR产物与KPnl和Xbal双酶切peDNA3.lhis片段连接,连接 产物转化感受态大肠杆菌,氨节青霉素抗性筛选阳性克隆。提取质粒 经酶切和测序鉴定,结果显示:hTH目的片段测序结果与报道序列同 源性达100%;PcDNA3.lhis一hTH酶切片段大小正确,说明已成功地 将盯H基因克隆到真核表达载体PcDNA3 .lhis中。其中,PcDNA3.lllis


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