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SARS冠状病毒S蛋白抗原表位多肽的设计、合成及其免疫反应

张嘉杰  
【摘要】:背景:SARS的感染是由SRAS-CoV引起的。SARS-CoV共有四种结构蛋白,S蛋白是冠状病毒表面最大的结构蛋白,在病毒与宿主细胞表面受体结合及介导膜融合并进入细胞的过程中起关键性作用。既往对冠状病毒S蛋白的研究表明,S蛋白是SARS-CoV与宿主细胞膜受体的结合部位,包含重要的中和抗原表位,是进行抗SARS疫苗设计的重要位点。S蛋白突变率较低的冠状病毒,通过S蛋白已经获得了有效的疫苗。SARS-CoV的S蛋白的氨基酸突变率不高,通过S蛋白很有希望获得有效抗的SARS疫苗。 目的:本实验将根据SARS-CoV S蛋白的序列,通过网络共享软件对S蛋白的二级结构、理化性质和S蛋白的抗原表位进行生物信息学预测与分析,并根据预测结果设计并合成出一系列的候选抗原表位多肽进行免疫学研究。通过将合成的抗原表位多肽与SARS康复病人的血清反应,以及在动物体内的免疫反应,以发现S蛋白的抗原表位,从而为基于S蛋白的亚单位疫苗深入研究打下基础。 方法:利用Expasy提供的网络共享工具软件Proteomics and sequence analysis tools对S蛋白的二级结构预测,信号肽切割位点,穿膜螺旋,N-糖基化位点,O-磷酸化位点,半光氨酸结合状态,亲水性,可及性,β-转角进行预测。利用http//mif.dfci.harvard.edu提供的PREDICTING ANTIGENIC PEPTIDES软件对B细胞抗原表位进行预测。利用http://www.imtech.res.in/提供的软件nHLAPred和ProPre分别进行MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ限制性的T细胞抗原表位预测。根据B细胞抗原表位预测结果设计并合成抗原表位多肽。抗原表位多肽采用Fmoc-butyl固相合成侧链保护策略,在多肽合成仪上进行合成,HPLC进行纯化,电喷雾电离法(electrospray ionization source,ESI)进行结构鉴定。抗原表 第一军医大学博士论文 位多肤采用间接ELISA法测定SARS相关冠状病毒抗原表位肤与SARS 病人血清中抗体的反应。根据抗体反应呈阳性的抗原表位多肤,综合S 蛋白的二级结构和理化性质及T细胞抗原表位的预测与分析结果,设计 并合成新的抗原多肤。综合设计的抗原多肤采用皮下注射的方式对新西 兰家兔进行免疫。用间接ELISA法检测免疫家兔产生抗体的滴度。 结果:预测结果表明,在S蛋白中存在一个球状结构区域(Sl区) 和三个螺旋区( 52区),螺旋结构分别位于残基729一769,880一1015, 1163一1184。S蛋白的信号肤切割位点位于N一端的13位氨基酸残基(Gly) 和14位氨基酸(Ser)残基之间。S蛋白在11%一1218之间存在一段穿膜 螺旋结构,1一1 195段处于胞膜外,1219一1255则在胞膜内。S蛋白共 有23个糖基化位点,其中有10个糖基化的可能性很高,7个糖基化程 度一般,6个糖基化程度较低。S蛋白共有196个O一磷酸化位点,包括 96个Ser和100个Thr的磷酸化位点。所有这些位点磷酸化的可能性都 不高。s蛋白的39个cys中只有4个形成二硫键的可能性高。它们分别 是255,725,731,522位的eys。s蛋白共存在10个暴露的片段,即 75一95,303一338,372一393,451一478,481一515,610一642,657 一690,789一825,1095一1140,1202一1242。S蛋白主要有七个亲水性 较高的区域,即166一212,260一348,367一470,507一572,749一772, 1118一1152,1229一1252。S蛋白在残基459一470存在明显的日一转角。 T细胞抗原表位的预测结果表明,共有11个肤段被预测为HLA一I分子 的混杂性抗原表位,共有9个肤段被预测为HLA一11分子的混杂性抗原表 位,共有7个九肤段被预测为HLA一A2特异性抗原表位。B细胞抗原 表位预测结果表明,S一蛋白共存在氨基酸残基数目不小于7的抗原表位 位点61个。根据B细胞抗原表位预测结果共设计出47个抗原表位多肤, 并合成了35个抗原表位多肤。用ELISA检测,有六个抗原表位多肤与 SARS康复病人血清反应呈阳性结果,即S一7、S一14、S一17、S一20、N一5 第一军医大学博士论文 和N一19。综合设计的抗原多肤SV一1和SV一5在家兔体内产生了较强的免 疫反应,其免疫后的家兔血清可以检测到SV一1和SV一5的特异性抗体。 SV-7和SV- 10产生的免疫反应很弱。 结论:预测和分析了SARS一CoVS蛋白的结构、理化性质以及B 细胞抗原表位和T细胞抗原表位,有助于提高寻找S蛋白的抗原表位的 效率。设计并合成了35个S蛋白的B细胞抗原表位多肤,并进行了纯 化和结构确证,为发现S蛋白的抗原表位提供了一定的物质条件。发现 了6个S蛋白B细胞的抗原表位多肤与SARS康复病人血清反应呈阳 性,并发现S蛋白的两个抗原多肤片段在家兔体内能够产生其特异性抗 体,为抗SARS多肤疫苗的深入研究提供了新的实验依据。


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