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下呼吸道感染常见致病菌基因诊断的研究

樊慧珍  
【摘要】:目的:根据DNA分子碱基互补配对的原理和不同来源、具有互补序列的单链DNA在一定条件下可以形成异源双链DNA的特性,建立了一种利用病原菌特异长链DNA探针直接检测生物素标记细菌DNA的斑点杂交技术,以快速检测下呼吸道感染的常见致病菌。并将该方法应用于临床痰样本的检测,同时与痰培养和聚合酶链反应方法进行比较,探讨该方法在下呼吸道感染诊断中的应用价值。方法:1.选择肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌、甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌、甲氧西林敏感表皮葡萄球菌、甲氧西林耐药表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、嗜肺军团菌这10种下呼吸道感染最常见的病原菌,作为检测菌株。在这10种病原菌高度特异的基因序列内利用聚合酶链反应合成上述10种细菌特异的长链DNA探针,并将合成的特异探针固定在硝酸纤维素膜上,与用长臂光敏生物素标记后的模板DNA进行斑点杂交反应,通过观察杂交信号判断存在何种细菌感染,同时研究该方法的敏感性和特异性。2.利用上述斑点杂交方法检测100份社区获得性肺炎患者、150份医院获得性肺炎患者和50份非下呼吸道感染患者的痰标本,观察其检测结果,并与培养法和聚合酶链反应的检测结果进行比较。结果:1.所合成的11种DNA探针具有高度特异性,除了与其对应的标准菌株DNA有阳性杂交信号外,与其它菌株、真菌和病毒之间没有交叉反应。2.所合成的探针灵敏度为0.2ng。3.斑点杂交方法可以检测出1ng细菌DNA。4.斑点杂交方法可以检测出2种或2种以上致病菌的混合感染。5.斑点杂交法和培养法分别检测100份社区获得性肺炎患者的痰标本,其阳性检出率分别是53%和29%,两者在统计学上有显著性差异(P<0.01)。而PCR的阳性检出率是90%,与杂交法(53%)有显著性差异(P<0.01)。6.斑点杂交法、培养法和PCR法分别检测150份医院获得性肺炎患者的痰标本,其阳性检出率分别是62.7%、38%和93.3%,杂交法的检出率高于培养法(P<0.01),而PCR的检出率高于杂交法(P<0.01)。7.杂交法、培养法和PCR法分别检测50份非下呼吸道感染患者的痰标本,其阳性检出率分别是6%、8%和60%,杂交法和培养法之间无显著性差异(P>0.05),而PCR法的检出率高于杂交 法(P0 .01)。结论:1.通过细菌特异的长链DNA探针直接与样本DNA 进行斑点杂交以检测下呼吸道感染的病原菌是一种切实可行的方法。2. 在社区获得性肺炎患者的病原学诊断中,杂交法阳性检出率显著高于痰 培养法,杂交法尤其适用于呼吸道苛养菌和培养周期长的致病菌的诊断。 3.在医院获得性肺炎患者的病原学诊断中,杂交法阳性检出率显著高于 痰培养,杂交法尤其适用于留取痰标本前接受过抗生素治疗的患者。4. 所建立的斑点杂交法敏感性高、特异性强,可用于下呼吸道感染的早期 快速诊断,它为下呼吸道感染致病菌的诊断提供了一条新途径。


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