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人骨髓间充质干细胞集落培养及其生物学特性的研究

陈伟  
【摘要】:一、目的 (一)拟体外在集落水平上建立有效培养人骨髓间充质干细胞的一条技术路线。 (二)进一步研究人骨髓间充质干细胞增殖、分化等生物学特性,为问充质干细胞作为“种子细胞”在细胞移植和支持造血方面的临床应用奠定基础。 二、方法 (一)以健康自愿者骨髓为实验对象,密度梯度离心法和贴壁法结合筛选骨髓间充质干细胞,以套圈法获取骨髓间充质干细胞集落扩增培养。 (二)检测人骨髓间充质干细胞的生物学特性:包括1、hMSCs的表面标记检测;2、hMSCs的生长曲线测定,分别检测了P3、P8、16、P17代MSCs;3、克隆形成能力的检测,分别检测了P3、P8、16、P17代细胞;4、MSCs的冻存和复苏; (三)应用RA诱导hMSCs向神经干细胞的分化。 三、结果 (一)本实验所用培养方法能有效扩增集落来源的骨髓间充质干细胞,细胞倍增时间约为48~72h。传15代即使扩增的细胞总数达到(1~3)×10~(10)数量级。继续传代可传20代。 (二)流式细胞仪检测示细胞表达CD13、CD29、CD59、CD44、CD71而不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86、CD117,表明它是间充质干细胞而不是造血细胞。细胞的表面标记显示扩增的是骨髓间充质干细胞且纯度达97%以上,可视为集落来源的骨髓间充质干细胞。 (三)生长曲线示培养的细胞17代以前生长良好,17代以后细胞 生长明显变慢,光镜下形态变大、形状变为不规则,胞浆内及培养液中 可见较多颗粒,折光性差。克隆形成能力数:MsCsl7代前3、8、16无 明显差异(P0.05),17代后克隆形成能力降低,与17代前数代比有显 著性的差异(P0.05)。 (四)常规冻存方法能有效保存细胞,复苏后活细胞达96%以上, 细胞生长传代良好。 (五)体外诱导分化能力检测显示培养的细胞保持其分化潜能,可 分化成神经干细胞,诱导比例分别为25.6%。 四、结论 (一)本实验所用培养方法能有效扩增集落来源的骨髓间充质干细胞, 经表面标记检测、体外维甲酸(RA)诱导分化神经干细胞实验证实为 MSCs。细胞的生长曲线和克隆形成实验显示MSCS是一种生命力有限的 细胞。 (二)本实验方法简便可靠,扩增培养的细胞生长良好达(1一3) x 10’“数量级,并具有向神经干细胞定向诱导分化的潜能,不仅可以作 为“种子细胞”用于实验研究,还可满足临床细胞移植所需,有一定先 进性。


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