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前脑缺血后大鼠海马CA1区亚蛋白质组表达谱的变化

陈亮  
【摘要】:脑血管病严重危害人类健康,已成为当今第三大死亡原因及首位致残原因,并且随着老龄化社会的到来,其发病率呈明显上升趋势,而目前临床尚无理想的治疗手段。脑创伤是平时和战时常见的中枢神经致残和致死原因之一,脑创伤后继发性神经元死亡是造成伤病员致残、致死的主要病理机制,这种继发性神经元死亡也主要是由于损伤脑组织缺血缺氧所致。因此,以动物脑缺血再灌流模型模拟人类缺血性脑血管病并对之进行研究是当代神经科学的重大课题之一。 脑缺血再灌流后,海马CA1区锥体细胞发生迟发性神经元死亡(Delayed neuronal death, DND,即脑缺血再灌流2-3天后光镜下才见到CA1区锥体细胞的死亡),而CA3区的锥体细胞却几乎不受损害。Pulsinelli建立的大鼠短暂性前脑缺血模型是目前国际上研究迟发性神经元死亡机制普遍采用的模型之一。研究DND发生的机理,并寻找在DND发生前阻断神经元进一步死亡的有效途径,以减轻缺血性脑损伤的程度是脑缺血研究领域急待解决的重要问题之一。 脑卒中病理变化过程中,随着细胞组织的损伤、死亡,代谢物质的吞噬、降解甚至是内源性的修复,必然伴随蛋白质——生命活动的直接执行者——的表达量的上调、下调和修饰状态的变化,反之,也可以利用蛋白代谢人为干预脑卒中的发生发展过程。以往这方面已经做了大量的研究工作。 虽然以往这些研究设计精妙,从不同蛋白入手对脑卒中的机制研究做出了重要的贡献,却又有共同的美中不足,就是限于技术手段的选择,不能对生物体中数以千计的蛋白的表达量、修饰状态和相互作用进行全景式研究探索。 蛋白质组学作为一种新的学科和技术平台,所包含的技术手 段多种多样,其中的核心技术主要实现了蛋白质的高通量高效分 离、鉴定和所得信息的利用。现在一张效果良好的平板胶可以显 示出细胞内数以千计的蛋白质点,并通过染色、扫描、软件分析 得到蛋白质的组成,接着通过N端氨基酸测序、现代质谱技术等多 种方法结合可以分析确定蛋白具体序列成分甚至修饰状态。这样 就为我们重新更加全面的审视脑卒中时发生的细胞、组织事件提 供了新手段。近年来,该技术应用于老年性痴呆、癫痈和衰老等 动物模型的病理生理变化的研究,但尚未见到在脑缺血损伤方面 的研究报告。 本实验主要采用本实验室较为成熟的海马脑片分区显微切割 技术,加以改良后获取CAI区、CA3区和DG区组织,依照溶解性 不同顺序提取组织蛋白,富集膜蛋白,随后进行双向电泳、银染 色、专业软件辅助结合人工图像分析,得到了较理想的不同海马 分区细胞浆和细胞膜蛋白质图谱。 在此技术基础上,通过分析假手术组和缺血损伤组大鼠海马 CAI区蛋白组分的差异,拟获得与缺血损伤机制相关的蛋白。 经过软件分析和手工修正,在大鼠假手术组(N二6)和缺血损 伤组(N=6)海马CAI区之间共找到不能匹配的蛋白斑点6个,其 中3个膜蛋白斑点在缺血再灌注损伤组中消失,3个细胞浆蛋白斑 点在缺血再灌注损伤组中新出现,这些可能是与神经系统缺血性 损伤机制有关的蛋白分子,但是仍有待生物质谱和其它方法,如 免疫印迹法,进行印证。 本实验中建立的方法可以有效分离大鼠海马不同分区内细胞 浆和细胞膜蛋白,尤其对于相对少量的细胞膜蛋白可以有良好的 富集作用,而细胞膜蛋白常常在细胞内外信号转导和物质交换中 扮演重要角色。因而这一方法还可被广泛应用于研究神经系统的 其它方面。


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