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NICU常见致病菌寡核苷酸阵列检测方法的研究

沈德新  
【摘要】:[目的] 细菌感染是新生儿重症监护病房(Neonatal intensive care unit NICU)致病性和致死性的重要因素。目前诊断致病菌的方法,主要是在细菌培养和分离病原菌基础上依据血清学、形态和生化鉴定进行诊断。这种方法最大的弊端是培养和鉴定细菌耗时长,无法及时为临床提供抗生素选择依据,而盲目应用不恰当的抗生素可造成病原菌抗性积累。更有甚者,一些苛养菌难以培养或者不能被培养出来,根本无法提供病原菌信息。因此,早期、快速、简便、敏感地检测临床致病菌,是目前亟待解决的问题。本课题拟以16SrDNA为研究对象,旨在建立快速检测多种临床致病菌的寡核苷酸阵列方法。 [方法] 通过对83种常见细菌的16SrDNA序列比较分析,找出一段两端高度保守、中间相对变异的序列。依据其保守序列设计一对通用引物,用于扩增细菌16SrDNA目的序列。依据相对变异区域的序列设计常见的12种病原细菌的特异性探针,阵列于带正电或负电的尼龙膜上,与通用引物的PCR产物杂交,以判断样本中有无待检病原细菌及其种类。 同时探索探针固定的最佳方法,优化PCR反应条件及寡核苷酸阵列杂交条件,改进杂交液的配制,以提高寡核苷酸阵列杂交的灵敏度、特异性和杂交效率。 采用45株标准菌及123株野生菌对寡核苷酸阵列进行真实性、可靠性及价值评价,其指标包括:灵敏度、特异度、Youden指数、似然比、预测值等。 收集568份各类临床样本,比较传统细菌培养和寡核苷酸阵列检测方法对12种致病菌检出率的差异。 采用配对计数资料的卡方检验及Kappa系数检验进行统计学处理。 [结果] 建立了以16SrDNA为对象的寡核苷酸阵列检测方法。设计的 通用引物能有效扩增出常见的细菌目的序列;寡核普酸阵列应用于12种 NICU常见致病菌的检测,均能特异地与其检测细菌的通用引物PCR产物 杂交,说明探针具有很强的特异性。寡核普酸阵列检出DNA灵敏度高, 检出底限为IPg/林1。 通过对寡核普酸阵列建立方法的优化筛选发现:化学固膜法优于加 尾加紫外交联法;改进后的杂交液与传统杂交液相比使杂交时间由6h缩 短为30min;杂交温度控制在42℃一45℃之间杂交效果最佳。探针点膜浓 度以4pmol一1 OPmol最为实用;预杂交与否均在尼龙膜上表现出较清晰的 背景,不预杂交更为合适。 对寡核营酸阵列检测方法进行评价,阵列法检测165株菌的灵敏度 为96.1%,特异度为95.0%,Youden指数为0.91,阳性似然比为19.22, 阴性似然比为0.04,阳性预测值为98.4%,阴性预测值为88.4%。与细菌 培养检测结果比较无显著性差异(P=0 .453),两种方法吻合度良好 (k)0 .7)。 采用寡核普酸阵列和传统细菌培养方法分别检测568份临床样品, 结果显示:对于易养菌的感染,两种方法检测的灵敏度相近,吻合程度 良好(k0 .7);对于苛养菌感染,寡核普酸阵列检出率明显高于传统细 菌培养方法,二者具有显著性差异(P0 .05)。 〔结论〕以16SrDNA为对象的寡核昔酸阵列具有较好的种属鉴定能 力。可以简便、快速、特异地检测N工CU常见的12种致病菌。从接到样 品到判读出结果,整个过程大约需要6h。寡核普酸阵列是快速诊断NICU 常见感染病原菌的有效方法,适合临床检测的推广。


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