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SARS冠状病毒N抗原蛋白表达及血清抗体检测方法研究

许寅超  
【摘要】:目的:表达SARS冠状病毒核壳蛋白,研究建立SARS冠状病毒感染血清学的诊断方法。 方法:构建携带SARS冠状病毒核壳抗原融合蛋白质粒,将表达载体转入大肠杆菌,原核表达His-N融合蛋白,鉴定其免疫原性,利用纯化的重组SARS冠状病毒N蛋白包被微孔板,建立间接ELISA法定性检测人血清中抗SARS冠状病毒IgG抗体的检测方法,进行质量控制,并利用该方法,检测、观察404份SARS患者血清中抗体产生和变化规律。 结果:获得携带SARS冠状病毒核壳抗原基因的pQE-30/N质粒,通过大肠杆菌M15表达体系,在IPTG诱导条件下,可稳定表达融合蛋白His-N。蛋白纯化后经SDS-PAGE电泳,证实经过纯化融合蛋白的纯度达到90%以上,Western blot结果显示:可与确诊的SARS病人的血清特异性结合。以抗原包被浓度0.10μg/孔包被16h,选择1∶4000为酶结合物工作浓度,建立检测血清N蛋白IgG抗体的间接ELISA法。检测正常献血员548份血清标本,确定临界值。将该检测方法与参比试剂进行比较,检测临床确诊和血清学确证86例病人血清标本,对发病15天以上样本检测结果符合率达到100%。且血清标本N蛋白特异性抗体的阳性率均随着病程的延长而增高,符合SARS病毒感染后血清IgG抗体产生规律。因此,在选择基因工程抗原来代替SARS-CoV灭活裂解产物用于SARS的诊断时,N蛋白是最佳选择,并且由于不需要培养SARS冠状病毒,因而具有较高的生物安全性。 结论:用纯化基因工程SARS冠状病毒N蛋白建立的ELISA方法,可稳定地检测人血清中抗SARS冠状病毒IgG抗体,敏感性好,特异性强,N重组蛋白对于SARS诊断试剂的研究具有重要价值,用于SARS患者血清抗体水平的检测,为SARS临床诊断提供参考。


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