应用抑制消减杂交技术筛选大肠癌相关基因

【摘要】：大肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤,其死亡率呈增长趋势。目前研究认为:肿瘤的发生发展就细胞而言,是由于癌基因的激活与抑癌基因的失活而造成的。虽然对大肠癌发生发展过程中的基因变化已有较多的研究,但至今尚未发现与大肠癌发生发展有关的特异性基因,直接导致目前临床上对早期大肠癌诊断、治疗等各方面均缺乏有效的手段。随着近年来分子生物学技术的飞速发展,寻找大肠癌相关基因,深入了解肿瘤发生发展的分子机制已成为可能。 目的:利用抑制消减杂交技术(Suppression Subtractive hybridization SSH)构建大肠癌组织及癌旁正常粘膜之间差异表达cDNA文库,分离并克隆出大肠癌发病的相关基因,从基因分子水平探讨大肠癌的癌变机理,以期为大肠癌的早期诊断及基因治疗提供理论依据。 方法:以大肠癌组织和正常大肠粘膜作为研究对象,分别提取组织总RNA及mRNA并反转录成cDNA。以大肠癌组织cDNA作为Tester cDNA,正常粘膜cDNA作为Driver cDNA,经RsaI酶切,接头连接后进行连续两次消减杂交和两次PCR反应以获得差异表达基因片断。将PCR产物与T载体相连接并转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,构建人大肠癌消减抑制杂交cDNA文库。从库中随机挑取200个白色菌落,使用PCR方法鉴定阳性克隆并对其中50个克隆进行测序,将测序结果登录GeneBank进行同源性对比分析,并对部分有意义的差异表达片断进行Virtual Northern Blot分析。 结果:从大肠癌组织和癌旁正常粘膜提纯了高质量的总RNA和mRNA,完整反转录为cDNA后经RsaI完全酶切后,获得了长度均一性较好的短片段。高效