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分子信标荧光定量PCR技术检测志贺菌ipaH基因的研究

赵丽华  
【摘要】:目的:用分子信标荧光定量PCR技术检测志贺菌ipaH基因。 方法:根据GenBank上公布的福氏志贺菌M32063株ipaH基因序列,设计两对引物和一条分子信标探针。选取4株志贺菌标准菌株及大肠杆菌、肠炎沙门菌、金黄色葡萄球菌、链球菌,4种细菌作阴性对照,进行志贺菌ipaH基因特异性扩增;根据扩增结果及序列分析结果,选定福氏志贺菌M32063株ipaH基因序列第1236—1806位核苷酸目标序列,进行特异性扩增,提取纯化产物;将纯化好的PCR产物连接到pGEM-T载体上,得到pGEM-T-ipaH重组克隆载体;扩增pGEM-T-ipaH重组质粒的菌液,送生物技术公司测序,与GenBank上公布的福氏志贺菌M32063株ipaH基因进行核苷酸序列的比对;用无菌水按照10的倍数方法稀释pGEM-T-ipaH重组质粒,并得到梯度浓度的pGEM-T-ipaH重组质粒;取不同浓度pGEM-T-ipaH重组质粒作模板进行PCR及real-time PCR,根据实验需要,选择不同退火温度、Mg~(2+)浓度、探针浓度,最终得出优化后的real-time PCR反应条件;随后进行灵敏度分析、构建阳性标准品、通过拷贝数与Ct值之间的线性关系,制定标准曲线;收集20份未知临床腹泻患者粪便样本,进行分子信标荧光定量PCR技术检测志贺菌ipaH基因,为验证实验的可靠性,同时采用荧光终点法对20份未知临床腹泻患者粪便样本进行荧光值测定。 结果:本实验得出结果如下: 1.贺菌ipaH基因采用P1、P2和P3、P4两对引物,分别成功扩增出571bp和150bp片断,电泳结果显示特异性好、灵敏度高。 2.福氏志贺菌ipaH基因片断导入载体菌后,经过测序证实与NCBI基因序列的同源性为99%。说明实验用重组质粒中含有ipaH基因571bp的片断,可以作阳性标准品构建阳性模板。 3.选择不同的退火温度、Mg~(2+)浓度、探针浓度,优化real-time PCR反应条件。 4.本实验以10的倍数系列稀释标准品为模板,P3、P4为上下游引


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