青藤碱对RA患者树突状细胞免疫功能的影响及机制研究

【摘要】： 背景 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是最为常见的以关节炎症表现为主的自身免疫性疾病。在全世界,RA的发病率平均为1%,男女比例为1∶3,RA可发生于任何年龄阶段,发病的高峰为40-60岁。虽然,RA的发病遍布世界各个地区,但工业化国家的发病率一般比其他国家至少高3倍。RA的临床表现较为广泛,持续性和进展性的外周关节滑膜炎症、血管翳形成以及由此导致的骨和软骨的损伤是RA发病的主要特点。 RA的发病机制目前仍然没有阐明,目前认为RA是一种多因素联合介导的自身免疫性疾病。在RA的发病过程中,滑膜组织的慢性炎症引起RA患者关节滑膜成纤维细胞增生、血管过度形成,T细胞、B细胞、浆细胞以及巨噬细胞在RA关节滑膜中浸润。RA的发病以及疾病活动性都与HLA-DR4或HLA-DR1相关,这证明了T细胞在RA的发病中具有举足轻重的作用。RA可以被看作是未知抗原诱导T细胞活化介导的自身免疫病。MHC分子给CD4+T细胞提呈自身抗原是T细胞活化的第一步。在抗原的刺激下,炎症细胞分泌、合成炎症因子,引起滑膜炎症。树突状细胞(dendritic cells,DC)是功能最为强大的专职抗原提呈细胞,能够激活初始免疫反应。DC在免疫监视的淋巴组织中捕获、处理抗原,而后在移行至外周淋巴组织的过程中逐渐分化成熟。成熟的DC可将抗原肽提呈给T细胞,并促使Th细胞向Th1型或Th2型细胞分化,同时DC可表达协同刺激分子诱导调节性T细胞和B细胞免疫反应,分泌细胞因子产生相应的生物学效应。成熟的DC可活化淋巴细胞诱导免疫反应,而不成熟的DC则可诱导T细胞的对自身抗原的免疫耐受,减少自身免疫的发生。因此,DC在RA的发病中起着重要的作用。 RA属于祖国传统医学“痹病”范畴。“痹病”是因人体遭受风、寒、湿、热之邪的侵袭,气血为病邪阴闭而引起的疾病。以筋骨、肌肉、关节酸痛、麻木、重着、屈伸不利和关节肿大、灼热等为临床主要表现。按病因的不同可分为行痹、寒痹、湿痹、热痹、风湿热痹等。临床上具有渐进性或反复发作的特点。其主要病机是气血痹阻不通,筋脉关节失于濡养。因此,“痹病”以祛风、除湿、舒筋活络为治疗大法,并随其寒热而兼行清热或祛寒。清风藤用于治疗关节炎已经有两千多年的历史。青藤碱是清风藤的单体提取物,现代药理研究显示,青藤碱具有良好的抗炎和抗风湿的作用。虽然青藤碱的很多药理学活性,如抗炎、镇痛、免疫抑制、抗心律不齐等,已经逐渐被人们认识,但青藤碱的免疫抑制和抗风湿的机理尚未完全阐明。本研究观察了青藤碱对RA患者外周血DC免疫功能的影响,同时深入探讨了青藤碱对DC影响的机制,进一步阐明了青藤碱的免疫抑制和抗风湿机理。 目的: 1.建立人外周血DC体外培养体系; 2.观察青藤碱对RA患者外周血DC免疫功能的影响; 3.建立Toll样受体(toll like receptor,TLR)2 mRNA和TLR4 mRNA荧光定量PCR检测体系; 4.观察青藤碱对RA患者外周血DC中TLR2、TLR4 mRNA和蛋白表达的影响; 5.观察青藤碱对RA患者外周血DC中核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)活性和核易位的影响; 6.进一步揭示青藤碱免疫抑制的机理,进一步为青藤碱治疗RA提供理论和实验依据。 方法: 1.人外周血DC体外培养体系的建立 分离人外周血单核细胞,RPMI-1640完全培养基培养,采用GM-CSF和IL-4联合刺激,于培养第8天收获,即control DC。在培养结束前12h加入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(12μg/ml)刺激成熟,即LPS-DC。光学显微镜、电子显微镜观察DC形态。分离、培养同种异体T淋巴细胞,采用同种异体混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)检测DC对T细胞的刺激作用。直接免疫荧光标记细胞,流式细胞仪分析细胞表型。 2.青藤碱对RA患者外周血DC免疫功能的影响 将16名活动期RA患者随机分为青藤碱高、中、低剂量组和空白对照组,体外培养、诱导RA患者DC。于培养结束前12h在培养基中分别按照低、中、高浓度加入青藤碱溶液至终浓度为1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L,空白对照组加入等量溶解介质。MTT法检测青藤碱在0,1mM,2mM,5mM,10mM,15mM,20mM浓度下对DC的细胞毒性作用。收集青藤碱干预后的RA患者外周血DC,流式细胞仪检测DC表型,MLR检测DC对同种异体T细胞的刺激作用。收集DC培养上清,ELISA方法检测培养上清中IL-12p70含量。提取RA患者外周血DC总RNA,采用半定量RT-PCR检测CD80 mRNA、CD86 mRNA、IL-12p35mRNA的表达。 3.青藤碱对RA患者外周血DC中TLR2和TLR4表达的影响 青藤碱干预RA患者外周血DC,收集干预后的细胞提取DC总RNA并逆转录为cDNA。PCR扩增TLR2、TLR4、GAPDH cDNA片段,回收并纯化PCR产物。将TLR2、TLR4、GAPDH的PCR产物分别按10~8,10~7,10~6,10~5,10~4copies/μl梯度倍比稀释,荧光定量PCR仪检测并自动计算出样品的定量结果,描绘标准曲线。将各样本cDNA按照建立体系中的反应条件在荧光定量PCR仪上进行扩增,由电脑自动分析并计算出反应体系中待测样品cDNA达到设定阈值的循环数(Ct值)。以公式2~(-ΔΔt)计算出相对于空白对照组的青藤碱干预各组的DC中TLR2 mRNA、TLR4 mRNA的表达水平。提取RA患者外周血DC总蛋白,SDS-PAGE电泳分析后采用western-blotting检测TLR2、TLR4蛋白的表达。 4.青藤碱对RA患者外周血DC中NF-κB活性和核易位的影响 收集青藤碱干预后的RA患者外周血DC,提取DC总RNA和蛋白。半定量RT-PCR检测DC中RelB mRNA的表达,western-blotting检测青藤碱对RA患者DC中磷酸化p38MAPK和IκBα表达的影响。提取DC核蛋白,凝胶迟滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测RA患者外周血DC中NF-κB的活性。FITC标记DC内RelB蛋白,激光共聚焦扫描显微镜下观察DC中RelB核易位的情况。 5.统计学处理 采用SPSS10.0统计软件进行数据分析,结果以(?)±S表示,两种处理因素设计的均数比较采用析因设计的方差分析,并进一步分析处理的单独效应、主效应和交互作用;单因素设计的多组间均数比较采用One way-ANOVA,多个组分别与对照组比较采用Dunnett检验;两组间均数比较采用两独立样本t检验,P＜0.05为显著性差异。 结果: 1.在GM-CSF和IL-4联合刺激的作用下,单核细胞成功的分化为DC。在光镜和电镜下观察可见其呈现典型的树突状形态,流式细胞仪检测其表达CD1a、CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR,并且随着DC数目的增多其对T细胞刺激能力逐渐增强。经LPS刺激后,与control DC相比,LPS-DC表现为典型的成熟DC形态,其特异性的表面分子CD1a(P＜0.05)、CD40(P＜0.01)、CD80(P＜0.01)、CD83(P＜0.01)、CD86(P＜0.01)、HLA-DR(P＜0.01)表达增高,T细胞与其比例分别为5∶1(P＜0.01),10∶1(P＜0.01),20∶1(P＜0.05),50∶1(P＜0.05)的情况下对T细胞的活化能力均较control DC强。 2.经1mM,2mM,5mM,10mM青藤碱溶液干预后的DC其细胞活力与对照组无显著性改变(P＞0.05),经15mM,20mM青藤碱溶液干预后的DC其细胞活力与空白对照组相比有显著性降低(P＜0.01)。青藤碱中、高剂量组CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。在DC与同种异体T细胞不同混合比例下,青藤碱中、高剂量组T细胞活化均有显著降低(P＜0.01)。经青藤碱高剂量(P＜0.01)干预后的DC培养上清中IL-12的含量均有所降低。青藤碱中、高剂量组CD80 mRNA、CD86 mRNA、IL-12p35 mRNA表达均有所减低(P＜0.01)。 3.经阳性梯度定量模板数与Ct值关系对数拟合作图,得到不同梯度定量模板的对数值与循环数(Ct值)之间关系的标准曲线,分别有着非常好的相关关系(r值分别为0.9985,0.9945,0.9912)。荧光定量PCR检测结果显示,与空白对照相比,经中、高剂量青藤碱干预后的DC中TLR2 mRNA表达均有所有降低(P＜0.01);经中、高剂量青藤碱干预后的DC中TLR4 mRNA表达均有所有降低(P＜0.01)。Western-blot检测结果显示,与空白对照相比,经低(P＜0.05)、中(P＜0.01)、高(P＜0.01)剂量青藤碱干预后的DC中TLR2表达均有所有降低;经中、高剂量青藤碱干预后的DC中TLR4表达均有所有降低(P＜0.01)。 4.PCR扩增结果显示,青藤碱4个剂量组之间RA患者外周血DC中RelBmRNA表达无显著性差异,Western-blot检测结果显示,经青藤碱干预后4组磷酸化p38和IκBα的表达均有所改变,但p-IκBα的改变有统计学差异,p-p38的改变无统计学差异;与空白对照相比,经中、高剂量青藤碱干预后的DC中p-IκBα表达所有降低(P＜0.01)。凝胶迟滞实验结果显示,核蛋白中NF-κB与探针的结合具有特异性。经青藤碱低(P＜0.05)、中(P＜0.01)、高(P＜0.01)剂量干预后DC NF-κB活性均有所降低。经青藤碱中、高剂量干预后DC中RelB核易位均有所减少(P＜0.01)。 结论: 1.以外周血单核细胞为前体,以GM-CSF和IL-4两种细胞因子为刺激,可充分诱导出具有免疫功能和特征形态、表型的人外周血DC。 2.青藤碱可能通过抑制RA患者DC的免疫功能而阻断RA患者自身反应性T细胞的活化,控制其介导的炎症损伤,最后达到缓解和治疗RA的作用。 3.青藤碱可能至少从以下几个方面抑制了RA患者DC的成熟或成熟DC的功能,从而抑制了RA患者自身反应性T细胞的异常活化:(1)青藤碱可抑制DC表达MHCⅡ类分子,阻断或减弱了DC对自身反应性T细胞的提呈自身抗原的能力,抑制了自身反应性T细胞的增殖;(2)青藤碱可抑制DC协同刺激分子的蛋白和基因的表达,阻断或减弱了DC为自身反应性T细胞提供的协同刺激信号,抑制了自身反应性T细胞的活化;(3)青藤碱可抑制DC合成和分泌IL-12,阻断了DC对活化后的自身反应性T细胞的诱导和分化能力,抑制了自身反应性T细胞的分化。 4.青藤碱对DC免疫功能的影响可能通过对TLRs的作用而产生。 5.青藤碱对RA的治疗作用可能也与其阻断了TLRs对RA发病相关因素的识别,抑制RA发病因素对RA患者免疫的异常活化作用有关。 6.青藤碱可有效抑制NF-κB的活性,但不抑制NF-κB的表达。 7.青藤碱对DC免疫功能的影响可能与其抑制DC中IκB的磷酸化,降低NF-κB的活性,抑制RelB亚基的核易位有关。