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肾衰养真胶囊对慢性肾衰竭营养不良大鼠瘦素受体基因表达及信号传导的影响

李玉明  
【摘要】: 营养不良是慢性肾衰竭(Chronic Renal Failure,CRF)患者(包括透析和非透析)临床常见的重要并发症。肾功能下降,到肾小球滤过率(glomerular filtrationrate,GFR)约为20ml/min时,患者会出现营养不良,主要表现为血清白蛋白、血红蛋白、干体重等下降,低蛋白血症为营养不良的重要指标。国外文献报道,在维持血透患者中营养不良发生率高达70%,欧洲和北美六个透析中心共224例非卧床持续性腹膜透析(Continuous ambulatory peritoneal dialysis,CAPD)患者41%发生营养不良。国内报道65%以上终末肾脏病(end-stage renal disease,ESRD)人发生营养不良。营养不良可导致免疫功能低下、贫血等,甚至导致多脏器衰竭,其发生不仅影响CRF患者的预后,而且与其死亡率密切相关。CRF营养不良研究成为近年来国际国内肾脏病领域研究的重点课题。 CRF营养不良病因及发病机制十分复杂。CRF患者摄食减少,尿毒症毒素引起的恶心、呕吐,酸中毒,以及腹透(peritoneal dialysis,PD)和血透(hemodialysis,HD)丢失血浆蛋白质和氨基酸等各种原因均可导致营养不良。研究发现,CRF患者营养摄入减少,可能是导致CRF营养不良的重要原因。瘦素(Leptin)是新近发现由肥胖基因(Obese gene,Ob gene)编码的激素样蛋白,其分子量为16KD,主要功能是降低食欲,增加能量消耗,导致体重减轻。研究表明,Leptin与CRF关系密切,许多CRF患者,包括PD、HD、肾移植的终末期肾衰患者均合并高Leptin血症。Leptin主要由肾脏清除,Leptin经过肾小球滤过后在肾小管重吸收并被降解。正常大鼠静脉注射外源性Leptin后可迅速被代谢,随之尿中可检测到Leptin代谢产物。而大鼠双肾被切除后,其体内Leptin排泄明显下降至19%,可导致血浆Leptin水平迅速增高。因此各种疾病造成的GFR功能或肾小管功能损伤均可影响Leptin从体内的清除,导致Leptin在体内的蓄积。CRF时GFR下降,肾脏清除能力下降是Leptin升高的主要原因。另外CRF患者代谢紊乱如高胰岛血症、炎症、高胆固醇血症等均可上调Ob gene的表达,导致体内Leptin升高。有报道发现常规血液透析不能清除Leptin,腹膜透析可进一步升高其浓度。成功肾移植患者,早期Leptin血症可改善,但会再次出现高Leptin血症。研究发现,CRF透析患者血Leptin与体脂含量之比与患者蛋白质摄入量呈显著负相关,与血清白蛋白、转铁蛋白呈负相关,与蛋白分解率(protein catabolismratio,PCR)呈负相关。目前国内外许多学者亦发现Leptin与CRF营养不良关系密切,是导致CRF患者厌食和营养不良的重要因素,但缺乏深入的机制研究。 Leptin通过与受体相互作用发挥生物学效应,而受体后水平的信号传导是实现其功能的关键环节。Leptin受体(Obese gene receptor,Ob-R)分布在下丘脑弓状核(The arcuate nucleus of the hypothalamus,ARH)的神经肽Y(neuropeptideY,NPY)能神经元、兰肽、黑素浓集激素、食欲肽能神经元及下丘脑前阿黑皮素原与NPY能神经元共同表达的神经元。Ob-R属于Ⅰ型细胞因子受体家族,至少有六种亚型,其中Ob-Rb细胞内结构较长,为长型受体,具有Leptin受体的所有功能区,是主要的功能性受体,多在下丘脑表达。Leptin进入血循环后,通过位于脉络丛的Ob-Ra转运至脑脊液中,在下丘脑Leptin与其Ob—Rb结合,作用于酪氨酸激酶2(Janus Kinase,JAK2)/信号传导转录活化因子3(Signaltransducer and activator of transcription,STAT3)通路,使STAT3活化,并转移定位到细胞核,与特定基因启动子区域的DNA元件或其他的转录因子或附属的蛋白相互作用,调节靶基因的转录,使食欲下降,食物的摄入减少。 细胞因子信号传导的抑制因子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)、活化的STAT的蛋白抑制因子(protein inhibitot of activated STAT,PIAS)是最近研究发现一类新的细胞因子诱导的信号抑制因子,其参与JAK/STAT信号传导的负调节。研究发现SOCS、PIAS的表达依赖于STATs的存在。尤其是STAT的C末端。Leptin与其受体结合,通过激活JAK2/STAT3系统在发挥其信号传导作用的同时,也启动了该途径的负反馈性抑制环路,从而使JAK2/STAT3系统的活动得到平衡与控制。SOCS3专一由Leptin诱导产生,该过程需要JAK2/STAT3通路的参与,而诱导产生的SOCS3转而对JAK2/STAT3通路发挥抑制作用。已确认PIAS3在细胞因子的诱导下,能专一地结合活化的STAT3,并抑制相应的DNA结合活性与转录激活活性。Leptin的JAK2/STAT3信号传导研究目前仅限于单纯的理论研究或肥胖病人Leptin抵抗研究,它在CRF时的表达及对营养不良的影响尚不清楚,对CRF中Leptin受体基因表达及信号传导的研究无疑有助于揭示CRF营养不良发生的分子机制,从而为CRF营养不良研究提供新的契机。 由于CRF营养不良病因病机十分复杂,CRF营养不良临床治疗显得十分棘手,不可能找到特异性的药物。西医方面,一是替代疗法,如静滴氨基酸、白蛋白、能量合剂、水溶性维生素,注射重组生长激素及胰岛素生长因子—1(insulingrow facor-1,IGF-1),氨基酸透析等处理,以上疗效短暂有限且价格昂贵。二是口服药物开同,开同是一种必需氨基酸和酮酸的混合制剂,其本身不含氮,在蛋白合成过程中利用尿素,其疗效亦有限且价格较贵。以上均不适合我国国情,难以得到普遍应用,寻求一种经济有效的治疗方法迫在眉睫。中医药能有效改善营养不良,且在药效上各有侧重,作用机理和途径也有所不同,因此,积极寻求改善CRF营养不良的中药具有重要意义。 CRF属于中医的“关格”、“癃闭”、“水肿”、“虚劳”等范畴。临床研究发现CRF营养不良表现为面色萎黄,神疲乏力,纳差,消瘦,舌质淡,苔厚腻等。其起病缓慢,病史较长,病情迁延,较为复杂。其发病机制为脾肾衰败,气血亏虚,湿浊中阻。其中最为关键的是脾。脾主运化水谷精微、化生气血,若脾气衰败,运化无力,不能化生气血,则可导致气血虚损。故有“脾为后天之本,气血生化之源”之说。脾的运化也包括胃主受纳的功能,虽然人体有病,但若能维持正常的饮食,则可依靠人体的正气抗邪,即所谓“有胃气则生,无胃气则死”。这与CRF不能进食所需要的营养,出现营养不良,最后导致多脏器衰竭死亡是一致的。中医药治疗CRF营养不良有个别报道,大多采用健脾益气的方法,有一定的疗效,但大部分局限于临床观察,缺乏深入的机理研究。 中成药(Traditional Chinese Medicine,TCM)肾衰养真胶囊(Capsule of ShenShuai Yang Zhen,SSYZ),是导师魏连波教授的经验方,曾获国家自然基金、广东省自然基金、广州市科技计划、广东省科技攻关和广东省中医药管理局的资助,并获得国家发明专利,临床和动物试验证明该药具有不同程度的改善食欲,改善CRF营养不良,降低Leptin含量的作用。由于高Leptin血症与慢性肾衰竭营养不良关系密切,慢性肾衰竭普遍存在高Leptin血症,Leptin主要通过作用于下丘脑Ob—Rb发挥生物学效应,Leptin与其受体结合,激活JAK2/STAT3系统在发挥其信号传导作用的同时,也诱导产生抑制性SOCS3、PIAS3蛋白。Leptin的JAK2/STAT3信号传导在CRF时的表达及对营养不良的影响尚不清楚。有研究认为慢性肾衰竭大鼠存在明显的NPY、Leptin及其受体的代谢紊乱,过量的Leptin有可能通过增强受体的活性而增加下丘脑的转运及其信号传导,从而抑制NPY的表达,从而导致营养不良的发生。所以我们设想制造CRF营养不良模型,观察Leptin及其JAK2/STAT3信号传导在CRF时的表达及对营养不良的影响,观察中药肾衰养真胶囊是否通过调节信号传导蛋白阻止信号传导,阻止Leptin生物学效应,是否下调Leptin受体水平表达,下调Leptin水平,从而改善食欲,改善营养不良,进一步探讨SSYZ改善慢性肾衰竭营养不良的作用机制。 本实验采用5/6肾切除法或腺嘌呤法,同时予以4%酪蛋白饮食,制造大鼠CRF营养不良模型,观察大鼠一般状况(精神状态、食欲、毛色、体重等),测定血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(Serum creatinine,SCr)、血白蛋白(albumin,ALb)、血红蛋白(haemoglobin,Hb)、24h尿蛋白定量(24-hour urineprotein,24hUpro)。结果造模组大鼠体重、ALb、Hb水平均较正常大鼠显著降低,造模组大鼠BUN、SCr、24hUpro水平均较正常大鼠显著增加,说明慢性CRF大鼠存在显著营养不良状态,与以往文献报道一致。5/6肾切除二次术后10周末造模组体重下降20%,营养不良指标ALb、Hb显著下降,BUN、SCr、24hUpro显著升高。喂养腺嘌呤8周末造模组体重下降20%以上,营养不良指标ALb、Hb显著下降,BUN、SCr、24hUpro显著升高。造模成功后,符合条件的大鼠,随机分为模型对照组(CRF Control group,CC组)、开同治疗组(Ketosteril group,KT组)、肾衰养真胶囊治疗组(SSYZ group,SSYZ组),另设正常对照组(NormalControl group,NC组)。治疗4周。观察治疗期间及治疗后大鼠一般状况(精神状态、食欲、毛色、体重等),BUN、SCr、ALb、Hb、24hUpro及血Leptin水平。取上述各组动物下丘脑,用半定量反转录聚合酶链式反应(Reversetranscription-Polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测其下丘脑Ob—Rb的表达,免疫组化法、Western Blot法检测STAT3、SOCS3、PIAS3蛋白表达。取上述各组动物肾脏进一步作肾脏病理检测。用普通光镜法、电镜法、免疫荧光法观察大鼠肾脏病理。 5/6肾切除法或腺嘌呤法造模中均发现:CC组出现ALb、Hb、体重下降,BUN、SCr、24hUpro持续升高。SSYZ组ALb、Hb、体重也下降,也出现BUN、SCr、24hUpro升高,但治疗后,可以改善大鼠一般状况,升高ALb、Hb,增加体重,降低BUN、SCr、24hUpro。SSYZ组在升高ALb、Hb以及增加体重方面,作用与KT组相似,在降低BUN、SCr、24hUpro方面SSYZ组作用与KT组比较有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。对血清Leptin含量以及下丘脑OB—Rb基因表达研究结果表明:CC组大鼠血清Leptin水平显著高于NC组(P<0.001),CC组大鼠下丘脑Ob—Rb的表达较NC组显著上调(P<0.001),说明慢性肾衰竭存在高Leptin血症,存在下丘脑Ob—Rb表达增强,与以往文献报道一致。SSYZ组Leptin含量及OB—RbmRNA相对含量比CC组有显著降低(P<0.01,P<0.001)。SSYZ组优于KT组(P<0.05)。对下丘脑STAT3、SOCS3、PIAS3蛋白表达研究结果表明:实验大鼠下丘脑神经元STAT3阳性染色为棕黄色,以胞浆为主;阴性对照无STAT3阳性染色。与NC组相比CC组及SSYZ组STAT3表达均增强(P<0.001),但SSYZ组STAT3表达显著低于CC组(P<0.001)。SSYZ组作用与KT组比较有显著性差异(P<0.05)。实验大鼠下丘脑神经元SOCS3、PIAS3阳性染色为棕黄色,以胞浆为主,下丘脑神经元轴突、树突亦有SOCS3阳性染色;CC组、SSYZ组下丘脑SOCS3、PIAS3蛋白表达较NC组显著增强(P<0.001);SSYZ组SOCS3、PIAS3蛋白表达比CC组有显著增强(P<0.05)。SSYZ组作用与KT组比较有显著性差异(P<0.001)。5/6肾切除法造模中本实验结果表明CC组光镜下可见肾小球系膜区弥漫性增宽,PAS阳性的均质蛋白性物质明显增多,肾小球基质增多,系膜细胞增生,肾小球基底膜增厚(glomerularbasement membrance,GBM)等表现,CC组透射电镜观察结果为GBM呈阶段性增厚,有的模糊不清,上皮足突广泛融合或部分融合,滤过膜间隙增大,系膜区扩大,系膜细胞增多。经SSYZ治疗4周后的SSYZ组上述病理改变比CC对照组比较显著减轻;免疫荧光亦提示SSYZ组肾小球IgG少量阳性反应。提示SSYZ能够明显改善实验性CRF营养不良大鼠肾组织的病理变化,对CRF营养不良具有肾脏保护作用。腺嘌呤法造模中光镜及电镜均发现,SSYZ可以抑制腺嘌呤致CRF大鼠肾小球系膜细胞及基质增生,改善病理状态,减轻肾小管—间质损害。免疫荧光提示SSYZ组肾小球IgG少量阳性反应,少量金黄色结晶。与光镜、电镜结果一致。 综上所述SSYZ、KT显著改善CRF大鼠营养不良。SSYZ在改善营养不良方面,作用与KT相似。SSYZ改善营养不良的作用可能部份是通过增强SOCS3、PIAS3蛋白表达,下调STAT3蛋白表达进一步抑制受体后JAK2/STAT3信号传导通路中的活性,阻止Leptin生物学效应,下调OB-RbmRNA表达,降低Leptin水平而实现。SSYZ对CRF营养不良大鼠肾保护作用优于KT。


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