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珍珠层人工骨骨诱导作用及相关机制实验研究

杨春露  
【摘要】: 研究背景: 近年来,珍珠层(nacre)作为一种新型骨生物替代材料受到了更多的关注。珍珠层来源于海洋中软体动物双壳类珍珠贝科或蚌科动物的贝壳内层,其组成成分主要为文石型碳酸钙,并含有少量有机质和微量金属元素。我们前期研究表明:珍珠层人工骨能够促进兔桡骨长节段骨缺损的修复;在犬腰椎横突间骨融合及兔颅骨缺损的修复实验中均观察到明显的成骨作用。珍珠层人工骨具有低免疫原性、良好的生物相容性、可降解性、骨传导性和较好的成骨作用。珍珠层作为生物骨替代材料,与其他无机生物材料相比,其优势在于含有具有诱导成骨作用的功能成分。基于此,本研究从珍珠层中提取水溶性物质,通过细胞学及体内动物实验,探讨其对骨髓基质细胞(bone marrow derived stromal cells,BMSCs)向成骨细胞方向分化的作用及相关机制,并研究珍珠层水溶性提取物(water soluble matrix of nacre powder,WSM)与血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB)协同作用下的骨诱导作用,旨在探讨珍珠层人工骨骨诱导作用及相关机制。同时开展珍珠层人工骨与人骨髓基质细胞的相容性研究,为进一步临床应用研究奠定基础。 目的: 1.探讨WSM诱导人BMSCs成骨性分化的作用及机制,以及PDGF-BB在此过程中的协同作用。 2.建立成骨细胞—骨髓基质细胞复合培养体系,探讨共育体系中两种细胞的生物学特性及WSM对于复合培养体系生物学行为的影响。 3.观察WSM诱导的大鼠骨髓基质细胞与珍珠层人工骨复合后在大鼠肌袋内的异位成骨作用,进一步明确珍珠层人工骨的骨诱导作用。 4.研究珍珠层人工骨与人骨髓基质细胞的生物相容性。 方法: 1.体外分离培养人骨髓基质细胞(hBMSCs),利用形态学、测定细胞生长曲线、HE染色、Giemsa染色及流式细胞术等方法对hBMSCs进行鉴定。 2.低温状态下提取珍珠层粉(马氏珍珠贝)中的水溶性物质(WSM),利用真空冷冻干燥技术将其浓缩。不同浓度作用于hBMSCs,检测碱性磷酸酶活性,制定剂量-效应曲线,确定最佳作用浓度。 3.WSM及PDGF-BB作用于体外培养的第3代的hBMSCs,以地塞米松诱导培养基为阳性对照,利用流式细胞术检测WSM对hBMSCs细胞周期的影响。诱导后的不同时间点,分别采用Gormori法碱性磷酸酶(AKP)染色、茜素红钙化结节染色等方法评价WSM、PDGF-BB诱导hBMSCs成骨性分化的效能;同时采用One-step RT-PCR方法检测hBMSCs诱导前后骨形成蛋白(BMP-2)、转化生长因子(TGF-β1)、核心结核因子(Cbfa-1)等生长因子表达差异。 4.原代分离hBMSCs和人成骨细胞(OBs),将2种细胞置于Transwell共育环境中共同培养,建立hBMSCs-OBs共育体系。分别采用MTT、丫啶橙染色、AKP活性检测等方法初步评价共育体系中两种细胞增殖、凋亡及功能改变情况。WSM作用于共育体系,不同时间点利用One-step RT-PCR方法检测共育体系中hBMSCs细胞BMP-2、AKP、TGF-β1、Cbfa-1、Osteonection、Osteocalcin、Osteopontin等成骨标志基因表达情况,判断WSM对共育体系中hBMSCs成骨性分化的诱导作用。 5.分离培养SD大鼠骨髓基质细胞(rBMSCs),将rBMSCs种植于珍珠层人工骨材料上,利用WSM体外诱导培养7天后,植入3月龄SD大鼠背部肌袋内,分别以复合未诱导rBMSCs、单纯珍珠层人工骨材料作对照。于植入后1d、4、8和12周时行X线摄片,观察WSM诱导的rBMSCs-人工骨材料复合物在大鼠体内异位成骨情况。在4、8和12周取材,经大体观察、组织学和免疫组织化学染色方法检测异位成骨情况。 6.将hBMSCs与珍珠层人工骨材料及WSM共同培养,用倒置显微镜、考马斯亮蓝染色法、四唑盐(MTT)比色法、扫描电镜等方法,研究珍珠层人工骨与hBMSCs生物相容性。 结果: 1.hBMSCs细胞刚贴壁时呈三角形、圆形、纺缍形或多角形等不规则形状。传代后形成单层时呈典型的漩涡式生长。生长曲线呈“S”形。hBMSCs表达CD29、CD44、和CD105为阳性,而CD45、CD34表达为阴性。 2.WSM初提液经真空冷冻干燥方法浓缩至30mg/ml,不同浓度作用于hBMSCs。结果表明100μg/ml以下的WSM对hBMSCs的AKP活性影响不大,当达到150μg/ml时作用效果最显著,之后再增加浓度作用无明显增加,因此确定150μg/ml的WSM为本研究的实验浓度。 3.hBMSCs诱导后第3d及第7d,WSM组、PDGF-BB+WSM及诱导培养基组的AKP染色均为阳性,第7d时更为明显;而空白对照组及PDGF-BB组则仅见极少数的AKP染色弱阳性细胞,未见典型的AKP阳性细胞。hBMSCs诱导后第18天,诱导培养基组茜素红染色可见典型同心圆状的红色钙化结节;WSM组形成不成熟的钙化结节,较为典型;PDGF-BB+WSM组形成的钙化结节数量较多,体积小;空白对照组及PDGF-BB组未见明显钙化结节形成。 4.骨髓基质细胞-成骨细胞共育体系能够促进OBs的增殖与AKP的活性,同时抑制BMSCs的凋亡,促进BMSCs的趋化聚集。培养第7天,共育体系能够提高hBMSCs的BMP-2、AKP、Cbfa-1、TGF-β1基因的表达(P<0.05);WSM能够使共育体系中hBMSCs的BMP-2、AKP表达进一步提高(P<0.05);而WSM对Cbfa-1、TGF-β1、Collage-1、Osteonectin等基因表达无影响(P>0.05)。 5.复合WSM诱导后rBMSCs的人工骨植入大鼠肌袋内发生异位成骨:8周时有类骨质形成,12周时材料中出现较为成熟的板层样骨组织,其中可见小梁骨;复合rBMSCs的对照组12周仅有少量不规则小梁骨形成;单纯材料组仅见纤维结缔组织及肌肉组织长入材料,未见成骨发生。X线检查,组内比较,WSM+rBMSCs+人工骨组12周时材料的X线阻射密度值与4周时相比有统计学差异(P<0.05),其余两组各时间点无差异。组间比较,WSM+rBMSCs+人工骨组12周时阻射密度值高于其他两组,余未见差异(P>0.05)。 6.MTT法显示随培养时间的延长,珍珠层人工骨材料对hBMSCs生长与增殖无影响(各时间点P>0.05)。扫描电镜显示hBMSCs可在珍珠层人工骨材料表面良好生长,增殖并分泌基质,WSM能够促进hBMSCs总蛋白表达。 结论: 1.WSM能够诱导体外培养的hBMSCs的成骨性分化,PDGF-BB在此过程中具有协同效应,而PDGF-BB单独作用时无骨诱导作用。 2.BMSCs-OBs共育体系能够促进OBs的增殖及碱性磷酸酶的表达,降低hBMSCs的凋亡,促进hBMSCs的趋化聚集,提高hBMSCs的BMP-2、TGF-β1等因子的表达。 3.WSM能够促进BMSCs-OBs共育体系内OBs分化,提高hBMSCs的BMP-2、AKP等基因表达。WSM对OBs的成熟及BMSCs的成骨性分化具有双重促进作用。 4.WSM诱导后的rBMSCs与珍珠层人工骨复合后,在SD大鼠背部肌袋内可异位成骨,WSM具有诱导rBMSCs成骨性分化的作用。 5.珍珠层人工骨与hBMSCs具有良好的生物相容性。


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