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骨髓源性神经干细胞移植磁共振成像的Sinerem标记及大鼠脑缺血模型中的应用

陈中灿  
【摘要】: 研究背景 我国属脑血管病高发国家,脑卒中是我国疾病死亡和导致长期残疾的三大原因之一。缺血性脑梗塞约占卒中的80%,用组织纤溶酶原激活剂进行治疗的方法能使梗塞再通,但由于溶栓的副作用和较短的治疗时间窗而使其应用受到限制,因此,只有很小部分卒中病人能得到及时的溶栓治疗。而存活的患者往往伴有严重的残疾,即使最好的康复治疗也由于不可逆的脑损伤而疗效有限。因而,脑卒中的治疗仍需要寻找更好更有效的治疗措施。 由于受“中枢神经不可再生”旧理论的束缚和影响,长期以来神经细胞损伤后结构与功能修复的研究进展一直比较缓慢。20世纪末期,干细胞(Stem cells,SCs)的发现为人们治疗许多难治性疾病提供了新的历史契机。干细胞因具有很强的自我更新能力和多种细胞分化潜能而成为研究的热点,具有非常重要的理论研究和临床应用价值。其中,神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)的发现和证实,为治疗包括脑卒中在内的难治性中枢神经系统(Center neural system,CNS)疾病开辟了新的道路。目前,已证实的NSCs来源主要有:(1)大脑室管膜下区、海马和齿状回部位的干细胞,可在脑细胞受损伤时动员到局部,但数量与作用有限;(2)胚胎干细胞,是一类从着床前囊胚内细胞团或早期胚胎原始生殖细胞分离克隆出来的一类未分化的全能性干细胞,在适当条件下能向神经干细胞方向分化,因受到伦理道德上的约束只能应用于动物实验;(3)骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs),可以向NSCs、神经元和神经胶质细胞方向分化,为了与来源神经组织的NSCs相区别,将此种由骨髓基质细胞诱导而来的NSCs称为骨髓基质细胞源NSCs(BMSCs-D-NSCs)。由于BMSCs容易获取、可在体外大量扩增并在一定条件下能诱导成神经干细胞,因此成为NSCs的重要来源,不仅克服了从其它部位取材的危险性和局限性,也避免了胚胎组织移植中存在的伦理和免疫排斥问题。若将外源性基因导入待移植NSCs,使其在体内有效表达,则可达到长效修复受损伤脑组织功能和治疗的目的。因此,BMSCs-D-NSCs移植是一种极具潜力的治疗缺血性脑卒中策略。 NSCs移植到宿主后组织结构的改变与功能的改善程度是我们关注的重点,而这些移植的效果与移植细胞的状况密切相关,这些状况主要是细胞的存活、生长、迁移、分化情况、与周围组织的融合情况等。因此,上述细胞在宿主内转归过程是评价移植的重要内容。以往传统的方法主要是先处死动物,然后再利用组织学或分子生物学等方来观察干细胞移植后在体内的转归和如何促进行为学上的功能改善,使研究解剖学改变与行为学的恢复之间的关系研究受到限制,这种侵袭性的分析只能提供细胞的单一的“瞬间快照”(snapshot),不能对同一受试动物移植的干细胞及宿主进行动态连续的实时观察,而且细胞迁移路径和有些病变用组织学方法很难观察到,从而丢失许多重要的信息。同时,侵袭性的研究方法更不适用于人体,严重制约干细胞移植在临床上的研究与应用。所以,必须寻找新的手段来监测干细胞移植后在体内的情况,为解决临床应用的瓶颈提供可能。 超小超顺磁性氧化铁(ultrasmall superparamagnetic iron oxide,USPIO)是一类新型的纳米级的超顺磁性氧化铁微粒,由于其自身特殊的磁性,可在磁场作用下与周围组织进行不同的成像,如果用其标记干细胞,就可以进行影像学的无创监测。目前,还未见用来标记大鼠骨髓基质细胞移植脑卒中模型的报道。本研究课题通过磁共振(Magnetic resonance,MR)成像技术和体外细胞标记技术相结合的方法,利用USPIO Sinerem标记鼠BMSCs-D-NSCs并移植,研究Sinerem对BMSCs-D-NSCs的生物学影响,及移植缺血性脑卒中动物模型后在活体脑内的识别、存活、迁移、增殖等转归,探讨NSCs移植治疗脑缺血的机制和无创伤成像技术的适用性,为NSCs移植治疗脑卒中的临床应用与安全性奠定基础,并为干细胞治疗其它神经系统疾病提供有益的启示。 第一部分:SD大鼠骨髓基质细胞体外向神经干细胞诱导的实验研究 目的:通过细胞培养的方法对分离的大鼠骨髓基质细胞进行体外诱导,向神经干细胞方向诱导。 方法:无菌条件下获取大鼠股骨中的骨髓,用淋巴分离液经梯度离心分离骨髓基质细胞。用干细胞培养基/碱性成纤维因子/白细胞抑制因子/胎牛血清进行实验组的培养、诱导,以DMEM/F12培养基/胎牛血清进行对照组的培养,在倒置光学相差显镜下观察细胞的形态、数量等生长情况;利用计数法测定细胞生长曲线;利用免疫细胞化学方法对神经巢蛋白(Nestin)特异性分子标志物进行检测鉴定。 结果:细胞刚接种后在倒置显微镜下观察可见细胞呈悬浮状态,形态为圆形,大小均一,边缘光滑、完整。接种后24h,骨髓基质细胞开始贴壁,随时间的增加,贴壁细胞逐渐增多,大约3天后贴壁细胞数量不再增加,未贴壁细胞仍呈悬浮状。此时更换培养基后,除掉了其中的非粘附细胞,可见剩余较纯的贴壁细胞。剩余的贴壁细胞折光性强,体积较前期略增大,个别细胞出现核分裂相。5~7天时出现较多的分裂相,增殖明显,出现少许细胞克隆团,9~12天时细胞增殖旺盛,可见较多的细胞克隆团形成,围绕克隆团细胞向周围呈辐射状或旋涡状分布,大部分呈圆形或椭圆形。继续培养至18~20天时,大部分细胞形态开始发生变化,呈多边形、梭形等不规则状,从胞体发出的突起向远处伸展并可相互接触,类似于神经细胞间的联络。而在DMEM/F12培养的对照组,细胞接种后第8天左右时只有极少数量的克隆团出现,且随时间的延长数量增加不明显。 生长曲线说明,实验组细胞接种后7~9天开始进入对数生长期,至14~16天融合达80%。而对照组9~11天时进入对数生长期。 实验组细胞在接种培养第8天时检测到BMSCs-D-NSCs干细胞特异性抗原神经巢蛋白(Nestin)表达呈阳性,提示BMSCs诱导为BMSCs-D-NSCs。 结论:所用的分离骨髓基质细胞方法简单易行,在一定的条件下大鼠骨髓基质细胞可向神经干细胞方向诱导,具有很强的自我更新和多潜能分化能力,可作为干细胞移植的供体细胞。 第二部分:Sinerem纳米铁标记鼠BMSCs-D-NSCs及其生物学影响 目的:明确新型超小超顺磁性氧化铁纳米微粒(USPIO)Sinerem体外标记大鼠骨髓源神经干细胞所需的合适浓度和铁微粒在细胞中的代谢、存留情况,探讨Sinerem标记大鼠骨髓源神经干细胞的可行性,为标记细胞的磁共振成像奠定基础。 方法:无菌条件下手术取SD大鼠双侧股骨的骨髓,利用淋巴细胞分离液分离其中的骨髓基质细胞,体外培养诱导成骨髓源神经干细胞。首先USPIO Sinerem和PLL通过静电作用形成的复合物。再用不同浓度的Sinerem(0、25、50、100、200、500μg/ml)和细胞过夜进行标记,分别于标记后1、3、5、7、9、11~17d不同的时间点行MTT观察细胞增殖,并用流式细胞仪观察细胞的生长周期和凋亡情况;RT-PCR方法检测铁标志对干细胞相关基因表达的影响;利用免疫细胞化学方法分析铁标记对干细胞分化能力的影响。普鲁士蓝染色和透射电镜确定细胞内铁的摄取、定位情况及细胞的标记效率。 结果:细胞形态的观察:倒置显微镜下标记组与未标记组的细胞形态无明显区别,普鲁士蓝染色的强度伴随着培养基中Sinerem浓度的增加而升高,提示进入细胞中的铁随浓度升高而逐渐增加,对照的未标记细胞无蓝染。最佳浓度的确定:与未标记组相比,Sinerem浓度为200μg/ml或以下时,标记细胞的活力、凋亡率无明显变化(P>0.05),但200μ/ml已接近临界值,而浓度大于等于500μg/ml时与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。对基因表达的影响:在适当的浓度200μg/ml时标记细胞中的相关基因表达水平无明显改变。对细胞周期的影响:与未标记组细胞相比,流式细胞仪检测结果显示,标记组细胞G_1、S、G_2/M期的细胞所占百分比没有显著性差异,说明适当浓度时Sinerem标记对细胞周期没有明显的不良影响。对分化能力的影响:该浓度时标记细胞向脂肪细胞分化的情况与对照组相比差别不大。标记效率:经显微镜下计数观察,Sinerem标记干细胞效率为98%~100%。细胞内铁的鉴定:普鲁士蓝染色显示铁颗粒存在胞质中,电镜显示铁颗粒集中于内涵体/溶酶体中。 结论:超小超顺磁性Sinerem在合适浓度(200μg/ml)时能安全有效地体外标记骨髓源神经干细胞,且对细胞无短期或长期的毒性影响,为神经干细胞移植的无创示踪奠定了基础。 第三部分:Sinerem纳米铁标记大鼠BMSCs-D-NSCs体外磁共振成像研究 目的:应用磁共振成像技术观察Sinerem标记后的SD大鼠BMSCs-D-NSCs体外成像情况,初步评价磁共振成像体外示踪Sinerem标记干细胞的可行性,为下一步体内移植成像创造条件。 方法:分离SD大鼠骨髓基质干细胞,体外培养诱导成BMSCs-D-NSCs。以200μg/ml的浓度10~5个细胞用不同的SE序列T_1WI、T_2WI与T_3~*WI在2%的琼脂糖凝胶中模拟在体环境分别行4.7T扫描确定最佳的扫描序列。将不同浓度(0、25、50、100、200、500μg/ml)的Sinerem和干细胞(10~6个)共孵育培养过夜标记后置于2%的琼脂糖凝胶中,以SE序列T_2~*WI磁共振干细胞成像;并在磁共振下观察不同数量细胞200μg/ml Sinerem标记细胞(10~1个,10~2个,10~3个,10~4个,10~5个)的信号情况。观察细胞在浓度200μg/ml(10~6个)标记时经长期培养不同时间点时的信号变化。 结果:MR扫描结果提示序列T_2~*WI扫描的敏感性最强。不同浓度的Sinerem标记细胞的磁共振信号强度不同,随着Sinerem浓度的升高MR信号呈降低趋势,浓度为500μg/ml时信号强度最低,肉眼观察可看到浓度100μg/ml以上标记细胞的MR的信号强度明显低于对照样品,可进行区分。标记细胞数量达10~3个及以上时在磁共振下其信号变化能被观察到。10~6个标记细胞的信号随培养时间的延长逐渐增加,4w时仍能在磁共振下显示可区分的低信号。 结论:利用Sinerem标记的BMSCs-D-NSCs体外可在MR下呈现可视区别的低信号影,T_2~*WI序列是最敏感的序列;信号强度的高低可用于评估标记细胞的数量。Sinerem标记的细胞可用于磁共振下进行长期的示踪。 第四部分:Sinerem纳米铁标记大鼠BMSCs-D-NSCs移植大脑的活体MR示踪及组织学检测 目的:将USPIO标记的大鼠BMSCs-D-NSCs移植正常或缺血模型脑后,初步观察其在大脑中的存活、迁移和整合情况,确定体内MR成像示踪Sinerem标记干细胞的可行性。 方法:首先分离SD大鼠BMSCs,体外培养诱导成BMSCs-D-NSCs。将200μg/ml的Sinerem纳米铁标记BMSCs-D-NSCs后,将标记细胞(1×10~6个)用脑立体定向仪移植通过微量注射器注射到正常大鼠皮层或缺血模型大鼠纹状体。同时在正常大鼠的另一侧用未标记细胞作为对照。在不同时间点(1d、1w、2w、4w)以SE序列T_2~*WI行4.7T磁共振成像示踪,然后在不同时间点处死动物,用组织学方法观察标记细胞在脑内的转归情况。 结果:在非缺血模型:大鼠移植皮层的标记细胞在磁共振下呈T_2~*WI低信号区,而未标记细胞无信号变化,与周围脑组织不能区别;1w时低信号区未见明显位移,而至4w时检测到细胞沿胼胝体的轻度迁移。在缺血模型中:移植到纹状体部位的标记细胞磁共振扫描时呈低信号区,1w时可见低信号区开始向对侧方向迁移,随时间的增加至2w时迁移至胼胝体纤维,4w时进一步沿胼胝体向缺血侧迁移。处死动物后,组织学检测可见移植的标记细胞普鲁士染色阳性,标记细胞的分布与磁共振扫描的低信号区相一致。透射电镜下可见观察到标记细胞中存在的Sinerem铁颗粒,细胞和周围组织相互紧密接触,未见到突触样结构的形成,但从形态上可见到个别细胞胞体有向两极伸展的趋势。 结论:Sinerem标记的BMSCs-D-NSCs在动物活体内能在磁共振下显像,其在脑内存活、迁移等行为可被磁共振特异性示踪,可用于干细胞移植的无创监测。


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