构建基因工程骨髓源干细胞模拟GABA神经元分泌功能的实验研究

【摘要】： 癫痫(epilepsy)，作为一种常见的中枢神经系统(central neuvous system,CNS)疾病，影响着大约0.5～1.0％的人口，因其异常复杂的发病机理及表型异质性，其临床治疗一直是个棘手问题，也一直是神经内外科和神经医学基础研究的难点。药物治疗一般作为首选，但仍有20～40％患者发作难以控制，成为难治性癫痫，值得注意的是，新型抗癫痫药物(antiepileptic drugs, AEDs)也没有明显减少癫痫耐药的百分比；手术治疗已经取得很大进展，但仍停留在切除和毁损阶段，不是所有的难治性癫痫都适合手术，且相当一部分患者疗效尚不令人满意；迷走神经刺激术和γ-刀治疗效果的确切性和安全性尚需进一步评估。因此，探索新的有效治疗途径，成为神经医学领域的关注热点之一。 神经干细胞(neural stem cells, NSCs)移植和基因治疗(gene therapy)是癫痫治疗研究中的两个最新方向。NSCs具有自我更新、多向分化能力，可分化为各种神经胶质细胞和神经元谱系，具有明显的甚至远距离的病理上的趋向能力，沿轴突移行发展或在CNS局部分化，移植后可望修复动物疾病模型和人类疾病中该类受损的组织和细胞，有助于重建发育不良或受损的CNS分子和细胞环境，可考虑做为介导结构重建和基因转移的移植材料。基因治疗是应用分子生物学技术调节目的基因(与疾病发病及治疗相关基因)表达的一种新的治疗学方法，联合基因工程技术，将培养增殖的神经干细胞再植入哺乳动物脑内，可以适当整合入整个CNS并稳定表达外源基因，为包括癫痫在内的CNS疾病提供新的治疗手段。 癫痫的发生与脑内兴奋性和抑制性神经递质的失衡相关。γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)是脑内最主要的抑制性神经递质，癫痫患者或癫痫模型动物脑组织中多存在GABA能神经元不同程度的数量减少和神经功能的不可逆性缺失，这提示如能向脑内补充能够分泌GABA的神经细胞就有可能抑制癫痫的发作。谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase, GAD)是GABA合成的限速酶，其催化谷氨酸(glutaminic acid, Glu)脱羧反应生成GABA，因而GAD对于调节脑部兴奋性和抑制性神经递质功能平衡起着重要作用。在GAD的两个亚型(GAD_(65)和GAD_(67))中，GAD_(67)的减少对GABA递质合成和释放的减少起主要作用，因此，联合基因工程技术、NSCs培养技术和立体定向技术，将转染GAD_(67)基因的神经干细胞移植入脑内，增加GAD_(67)的表达，可以促进GABA的合成，达到抑制癫痫发作的目的。 本研究分五部分进行，重点探讨体外条件下，利用基因工程技术改造骨髓基质源性神经干细胞(Bone marrow stroma cells-derived neural stem cells,BMSCs-D-NSCs)，探索构建基因工程化成体专能干细胞模拟GABA能神经元分泌功能的可行性，并初步建立方法学的体外技术平台。 第一部分人类谷氨酸脱羧酶67基因的克隆及其两种真核表达载体的构建 目的克隆获取人类谷氨酸脱羧酶GAD_(67)基因，并构建pEGFP-C2-GAD_(67)及pcDNA3.1-GAD_(67)两种重组真核表达载体。 方法以人类胎脑组织cDNA为模板，应用GAD_(67)基因特异性引物，用PCR方法扩增目的片段；将目的片段插入PUC57克隆载体，酶切、测序鉴定；再将GAD_(67)的基因片段分别克隆至真核表达载体pEGFP-C2及pcDNA3.1，构建两种编码GAD_(67)的重组真核表达载体，筛选克隆，经PCR、XhoⅠ及BamHⅠ双酶切及测序鉴定。 结果成功扩增出人类GAD_(67)基因ORF全长，大小为1785bp；目的基因GAD_(67)成功克隆入PUC57载体，重组克隆载体命名为PUC57-GAD_(67)；GAD_(67)成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1及pEGFP-C2，筛选得到编码人类GAD_(67)基因的两种重组质粒，命名为pcDNA3.1-GAD_(67)及pEGFP-C2-GAD_(67)。PCR鉴定，以pEGFP-C2-GAD_(67)和pcDNA3.1-GAD_(67)为模板，均可扩出约1800bp大小目的条带；双酶切pEGFP-C2-GAD_(67)可切出约4.7kb和1800bp片段，双酶切pcDNA3.1-GAD_(67)可切出约5.4kb和1800bp片段；测序结果显示，两重组真核表达载体上编码的GAD_(67)序列均包含人类GAD_(67)基因ORF全长，共1785bp，编码594个氨基酸残基，与NCBI提供的人类GAD_(67)参考序列基本相符。 结论应用基因重组技术，从胎脑组织cDNA中成功获取人类GAD_(67)基因ORF全长，并成功构建pEGFP-C2-GAD_(67)及pcDNA3.1-GAD_(67)两种重组真核表达载体，为进一步研究该基因功能及探索癫痫的基因治疗提供了前提条件。 第二部分脂质体介导人类GAD_(67)基因在哺乳动物细胞COS-7中的表达及检测 目的分别从细胞、核酸和蛋白水平验证前期构建的编码外源性人类GAD_(67)基因的pEGFP-C2-GAD_(67)及pcDNA3.1-GAD_(67)真核表达载体在哺乳动物细胞中的表达情况。 方法培养COS-7细胞并观察其生长情况；利用阳离子脂质体Lipfectamine 2000将编码人类GAD_(67)基因的两种真核表达质粒分别转入哺乳动物细胞COS-7中；通过荧光显微镜直接观察或间接免疫荧光检测细胞内表达情况；利用RT-PCR方法检测细胞内GAD_(67) mRNA水平表达；利用SDS-PAGE和Westernblot验证GAD_(67)蛋白表达情况。 结果转染pEGFP-C2-GAD_(67)后24h在荧光显微镜488nm激发光下观察，见大量细胞呈现绿色荧光，至72h可见绿色荧光细胞增多，荧光更加明亮；转染pcDNA3.1-GAD_(67)后48h行免疫荧光检测，TRITC标记，在荧光显微镜520nm激发光下观察，见大量细胞发出红色荧光；两种转染细胞分别提取总RNA，RT-PCR产物电泳均可得到1800bp大小目的条带，证明均有GAD_(67) mRNA的表达；两种转染细胞分别提取总蛋白电泳后，在约67 KD位置均可见一明显蛋白条带，Western-blot均显示出目的印迹，在蛋白水平证实，GAD_(67)基因能够在COS-7细胞中正确表达出GAD_(67)蛋白。 结论本实验利用脂质体转染法将前期构建的编码外源性GAD_(67)的两种真核表达载体成功导入COS-7细胞，并分别从细胞、核酸、蛋白等多个水平证实在哺乳动物细胞系中能够实现有效表达，为下一步转染原代培养的BMSCs-D-NSCs奠定了重要基础，并提供了参考条件。 第三部分人类GAD_(67)基因转染骨髓基质源性神经干细胞并检测其表达情况 目的利用转基因技术将GAD_(67)基因转入BMSCs-D-NSCs，获得GAD_(67)基因改造的成体专能干细胞，使之能够分泌表达GAD_(67)蛋白。 方法利用密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓基质细胞(rat Bone marrow stroma cells, rBMSCs)，用专用NSCs培养基(专利号ZL.02134314.4)促其向NSCs方向分化，得到BMSCs-D-NSCs，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，免疫细胞化学检测细胞内巢蛋白(Nestin)表达；再利用阳离子脂质体Lipfectamine 2000将编码人类GAD_(67)基因的真核表达质粒pEGFP-C2-GAD_(67)及pcDNA3.1-GAD_(67)分别转染入BMSCs-D-NSCs，荧光显微镜下直接观察或间接免疫荧光法检测转染情况；利用流式细胞仪分析检测转染效率；应用RT-PCR方法检测转染细胞内GAD_(67) mRNA水平表达；应用SDS-PAGE和Western blot检测并鉴定GAD_(67)蛋白。 结果体外原代培养的BMSCs贴壁生长，72h后细胞呈梭形、三角形或圆形，培养5d检测有大量Nestin阳性细胞；多次传代后，长满的细胞可呈规则成排或漩涡状排列；培养3w后细胞分化，可有长突起生长并相互连接成网状。在荧光显微镜488nm激发光下直接观察转染pEGFP-C2-GAD_(67)后BMSCs-D-NSCs内绿色荧光蛋白表达情况，可见大量细胞发出绿色荧光，至72h可见绿色荧光细胞增多，荧光更加明亮；间接免疫荧光检测(FITC标记)转染pcDNA3.1-GAD_(67)后BMSCs-D-NSCs内GAD_(67)蛋白表达情况，在488nm激发光下观察，可见大量细胞发出FITC标记的绿色荧光；两种载体转染效率分别为39.3％和40.5％；RT-PCR检测两种质粒转染后的BMSCs-D-NSCs均可得到约1800bp目的条带，证实有GAD_(67) mRNA水平表达；SDS-PAGE检测转染细胞及培养基上清中蛋白均可见约67KD处有明显条带，培养基上清中比细胞中提取的目的蛋白浓度更高，Western blot证实该条带为GAD_(67)蛋白。 结论 本实验证实： 1．原代培养BMSCs，利用专用NSCs培养基，经体外培养扩增，可以促其向NSCs方向分化； 2．脂质体Lipofectamine 2000介导编码GAD_(67)的两种真核表达载体均能有效转染BMSCs-D-NSCs； 3．GAD_(67)基因改造的BMSCs-D-NSCs可以有效表达GAD_(67)蛋白，且分泌到细胞外培养基上清中的目的蛋白浓度比细胞内更高； 4．EGFP基因序列在GAD_(67)基因序列前，共用同一启动子，同框表达，没有影响GAD_(67)的转录、翻译、修饰，包括信号肽剪切等过程，没有影响GAD_(67)蛋白的分泌表达。 第四部分纳米载体介导GAD_(67)基因转染骨髓源性神经干细胞的初步研究 目的本实验试用纳米材料作为基因转移载体，对其DNA负载效率和对BMSCs-D-NSCs的转染能力做初步的研究；并从细胞、核酸和蛋白等多个水平检测在该纳米载体介导条件下GAD_(67)基因在BMSCs-D-NSCs内的表达情况。 方法利用丁二酸酐(Succinic Anhydride)与端基为羟基的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)反应，生成端基为羧基的PEG(PEG-COOH)，用N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxyl succimide，NHS)活化端羧基PEG(PEG-COOH)后与聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)反应，得到PEG与PEI的接枝共聚物_bPEI-g-_1PEG，利用~1H NMR分析表征，利用梯度混合琼脂糖凝胶电泳(AGE)检测PEI-g-PEG对DNA负载效率；利用密度梯度离心法分离培养大鼠原代BMSCs，用专用NSCs培养基促其向NSCs方向分化，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，免疫细胞化学检测细胞内巢蛋白(Nestin)表达；利用PEI-g-PEG共聚物介导pEGFP-C2-GAD_(67)真核表达载体转染BMSCs-D-NSCs，荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光蛋白表达情况；RT-PCR鉴定GAD_(67) mRNA的表达，SDS-PAGE和Western blot鉴定GAD_(67)蛋白。 结果~1H NMR分析表明，接枝反应发生后，在2.5～3.0 ppm处出现PEI的振动峰，说明PEG成功接枝到PEI链段上。bPEI-g-lPEG共聚物对pEGFP-C2-GAD_(67)质粒DNA最适负载比例为5～10：1。bPEI-g-lPEG纳米载体介导pEGFP-C2-GAD_(67)转染BMSCs-D-NSCs 24h后即可见大量细胞发出绿色荧光，至72h可见绿色荧光细胞增多，荧光更加明亮。转染效率约25％～35％，推荐转染剂量为PEI-g-PEG用量20～40μg/孔，DNA0.8～1.6μg/孔(24孔板)。转染48h后提取总RNA，RT-PCR产物电泳可得到1800bp大小目的条带，证实有GAD_(67) mRNA的表达。提取总蛋白及留取培养基上清，SDS-PAGE均可发现67KD处有较浓蛋白条带，Western blot证实为GAD_(67)蛋白。 结论本实验合成PEI-g-PEG共聚物作为基因转移载体，负载pEGFP-C2-GAD_(67)，成功转染BMSCs-D-NSCs，并能够正常分泌表达GAD_(67)蛋白。 第五部分RP-HPLC-荧光法检测GAD_(67)基因工程干细胞培养基中GABA的含量 目的测定基因工程干细胞培养基中GABA含量，间接了解转染GAD_(67)基因的BMSCs-D-NSCs中表达的外源性GAD_(67)蛋白的功能活性。 方法RP-HPLC-荧光法。色谱条件：岛津C_(18)反相色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；衍生化试剂为邻苯二甲醛(OPA)；流动相为甲醇-0.02mol·L~(-1)K_2HPO_4(45：55)，pH 6.8；检测波长：激发光波长λ_(Ex)为335nm，发射光波长λ_(Em)为445nm；流速1.0ml／min。外标法定量。利用C-R1B数据处理仪自动记录数据，利用Excel2003及SPSS13.0统计软件进行数据转换和数据汇总。 结果方法学确证：GABA在测定范围内(0.1～20μmol·L~(-1))峰面积(A)与浓度(C)线性关系良好，回归方程为Y=1577.06X+448.95，相关系数(r)为0.9989；方法回收率大于90％；精密度：日内差小于7％，日间差小于11％；最低检测浓度为0.1μmol·L~(-1)。色谱行为：GABA的保留时间为10.6 min，峰形态良好，与其他杂峰分离清楚。检测计算转基因干细胞培养基原液中GABA浓度约为31.50μmol·L~(-1)，而对照培养基中未检测到有大量GABA生成(低于0.1μmol·L~(-1))。正常人或动物脑脊液中GABA含量大约在100～260nmol·L~(-1)之间，与之相比，基因工程干细胞培养基中可得到高达100～300倍含量的GABA。 结论转基因BMSCs-D-NSCs分泌表达的GAD_(67)蛋白具有良好的功能活性，做为限速酶可以催化生成大量GABA；转基因干细胞培养基中的高浓度GABA为其表达的外源性GAD_(67)蛋白催化而成，并非为细胞自身产生。 小结 BMSCs是NSCs的主要来源之一，也是细胞移植治疗CNS疾病的重要的种子细胞，但目前尚难以将BMSCs高效诱导分化为特定的分泌单相递质的功能神经元，包括GABA能神经元。基因工程技术可以作为调节细胞内递质分泌的有效手段，使移植的干细胞更专一、有效地发挥特定功能。 本实验研究表明： 1．利用分子克隆技术，从人类胎脑组织可以成功获取GAD_(67) ORF全长；构建的pEGFP-C2-GAD_(67)及pcDNA3.1-GAD_(67)两种真核表达载体，均可有效启动GAD_(67)的基因表达； 2．作为基因转移载体，脂质体lipofectamine 2000和纳米材料bPEI-g-lPEG都可以有效介导GAD_(67)基因转染BMSCs-D-NSCs； 3．转染GAD_(67)的基因工程干细胞能够分泌表达目的蛋白，且表达的外源性GAD_(67)蛋白具有良好的酶活性，可以催化生成高浓度的GABA； 4．作为一种荧光标签，pEGFP-C2-GAD_(67)载体上的EGFP序列编码在GAD_(67)序列前，与之共用同一启动子，同框表达，没有影响GAD_(67)的转录、翻译、信号肽剪切等过程，没有影响GAD_(67)蛋白的分泌表达及功能活性。 本实验表明，GAD_(67)改造的基因工程BMSCs-D-NSCs可以模拟GABA能神经元发挥GABA递质分泌功能，并初步建立了分泌GABA的基因工程干细胞体外技术平台，为未来细胞移植和基因治疗癫痫奠定了实验基础。