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人胎肝细胞长期培养及重组HBV腺病毒的感染

王雪刚  
【摘要】: 背景: 乙肝病毒(HBV)感染仍然是一种严重影响人类健康的全球性疾病,全球大约有20亿人曾经感染过乙肝病毒,其中超过3.5亿人成为慢性感染者,每年可导致120万患者死亡,而且每年有32万患者死于HBV感染导致的肝癌。我国属于肝炎高发区,现患乙型肝炎为2800万。 乙肝患者中25%~40%最终将死于肝硬化和肝癌,失代偿性肝硬化的5年生存率约为15%,对于重症肝病的治疗,以保守治疗为主,不能解决根本问题,最终只能寄希望于原位肝移植。 由于健康供体肝脏的严重短缺且费用昂贵,仅有少数需要肝移植的患者可以接受原位移植治疗。肝细胞移植技术为解决这一矛盾提供了新的思路和方法,同时也可能更适合我国大量患者的经济承受能力。肝细胞移植治疗重症肝病,具有创伤性小、费用低廉、安全性高,免疫原性小,而且一个供体可以为多个受体提供细胞来源。经过多年的基础研究,肝细胞移植已经初步应用于临床,目前已有多位患者接受了同种异体肝细胞移植或自体肝细胞移植(应用或不应用基因修饰),证实肝细胞移植对于治疗肝脏遗传性疾病及各种原因引起的肝衰竭有应用价值。 目前用于临床肝细胞移植的细胞主要来源包括:成体肝细胞、胎肝细胞。处于临床前研究阶段的细胞来源包括:异种肝细胞、肝前体/干细胞、永生化肝细胞、基因修饰自体肝细胞移植等。 本文主要探讨胎肝细胞的长期培养及重组1.3拷贝HBV腺病毒感染人胎肝细胞。 目的: 1、为肝细胞移植的临床应用及科研提供可靠的细胞来源。 2、建立长期培养胎肝细胞的平台,为进一步研究胎肝细胞做基础。 3、建立重组1.3拷贝HBV腺病毒感染胎肝细胞的体外模型,观察了解HBV在胎肝细胞中的复制表达情况。 1、材料与方法: 1、胎肝细胞的分离 1.1胎肝来源于南方医院妇产科流产胎儿。 1.2采用改良两步胶原酶灌注法,经脐静脉灌注胎肝分离胎肝细胞。 2、胎肝细胞的冻存:胎肝细胞的保存:冻存细胞密度为5-7×10~6/mL;冻存液由RPMI1640基培:人AB血清:DMSO终浓度比例为6:3:1构成;采用阶段降温法,即4℃、60分;-20℃、30分;-80℃、18小时;最后置于液氮中保存。 3、胎肝细胞的复苏:采用常规快速复温法,液氮中取出冻存管,迅速投入37~38℃水浴中,1分钟快速融化。 4、长期培养胎肝细胞方法的建立:胎肝细胞在用血清培养基贴壁生长4小时后,Ham's F12基础培养基洗涤细胞,以去除培养液中胎牛血清、造血细胞及未贴壁的胎肝细胞。更换用Ham'sF12基础培养基做母液,其中添加地塞米松、胰岛素、胰高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子和生长激素等配制成不含血清的条件培养基,每2天更换一次新鲜配制的条件培养基, 5、重组1.3拷贝HBV腺病毒感染胎肝细胞 5.1重组1.3拷贝HBV腺病毒:本室保存。 5.2胎肝细胞:我科分离冻存的胎肝细胞,细胞活力为84%。 5.3重组1.3拷贝HBV腺病毒感染胎肝细胞,孵育2小时后,洗涤细胞10次,细胞培养7天后收集上清,培养上清中HBsAg、HBeAg的表达水平用雅培全自动微粒子酶联免疫分析法进行检测;上清中HBV DNA载量采用实时荧光定量PCR法检测;胎肝细胞内HBsAg及HBcAg的检测用常规免疫组化法。 结果: 1、采用两步胶原酶灌注方法,在4℃条件下,在分离后的0、30、54、104、126小时,胎肝的活力分别为83%、78%、70%、65%、0%。应用10%DMSO冻存胎肝细胞,1周、2周、2月后复苏胎肝细胞,活力分别为84.17%、82%、84%。用倒置相差生物显微镜对培养胎肝细胞进行观察显示:胎肝细胞接种后2-3小时开始贴壁、伸展,约6小时后完成贴壁过程;24小时后细胞由圆球形逐渐转变为不规则多边形,细胞核清晰可见,细胞相互连接,部分肝细胞呈双核;用不含血清的条件培养基在培养3天后肝细胞间相互接触、满布培养瓶,在培养的10天、15天、30天及45天,倒置相差生物显微镜观察仍清晰可见形态规则的单核细胞以及正在分裂的双核细胞,流式细胞仪检测胎肝细胞高表达CD90及CD34表面标记物,美国雅培全自动微粒子酶联免疫分析法检测到特异性AFP。 2、重组1.3拷贝HBV腺病毒感染胎肝细胞2小时后,洗涤10遍后,培养7天后,上清中HBsAg、HBeAg及HBV DNA定量显著增加,常规细胞免疫组化可检测到胎肝细胞内HBsAg及HBcAg的表达。 结论: 1、经脐静脉插管两步法分离胎肝细胞是一种有效简易的方法。 2、分离冻存的胎肝细胞可为临床及科研提供稳定的细胞来源。 3、采用条件培养基可在体外长期培养胎肝细胞达2月。 4、HBV可在胎肝细胞中进行复制表达。


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