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新型实验动物—西藏小型猪氟烷基因、瘦素基因研究

赵乐  
【摘要】: 西藏小型猪是我国特有的高原型小型猪品种,具有开发培育成实验用小型猪的广阔应用前景。氟烷基因又称兰尼定受体基因或钙离子释放通道基因,是导致猪应激综合征和人类恶性高热的主效基因。瘦素是一种主要由脂肪组织表达分泌的激素蛋白,其主要功能是作用于下丘脑体重调节中枢,引起食欲下降和能量代谢增加从而减轻体重。瘦素基因的表达异常和瘦素抵抗现象与肥胖症有密切的关系。 本研究的目的在于探讨西藏小型猪群体氟烷基因座位的群体结构特征,检测西藏小型猪个体的氟烷基因型,筛选出有应激敏感性的氟烷基因隐性纯合子个体(HAL~nHAL~n)以及含有应激敏感基因的杂合子个体。通过对基因型频率的测定为最终将西藏小型猪培育成具有抗应激能力的实验用小型猪品系提供基础资料。同时对筛选出的氟烷基因隐性纯合子个体进行研究,探讨其作为一种自发性人类恶性高热疾病模型的可行性。西藏小型猪的最显著特点就是体型小和脂肪含量低,预示其在体脂调节机制上可能与大型猪种存在差异,本研究对瘦素基因开展研究,旨在首先在本实验室建立一套从脂肪组织中提取总RNA、逆转录获得瘦素基因的方法,初步探讨西藏小型猪瘦素基因在核酸序列上与其他猪种的差异,比较西藏小型猪瘦素基因与人、小鼠和其他猪种的相似性,寻找西藏小型猪瘦素基因核酸序列上的特异性位点,探讨这些特异位点与西藏小型猪体型小的关系。为进一步探讨用西藏小型猪建立人类肥胖症、糖尿病、心血管系统疾病等疾病动物模型的可行性奠定基础。 本研究分别采用PCR-RFLP和RT-PCR的方法对西藏小型猪氟烷基因和瘦素基因展开研究。首先采集50头西藏小型猪的血样,提取全血基因组DNA,以36份杜洛克猪和20份长白猪基因组样本为对照,用特异性引物扩增3个猪种的氟烷基因片断,然后进行限制性内切酶酶切,用琼脂糖凝胶电泳对酶切结果进行鉴定,通过基因型辨读,获得群体的基因型频率特征数据。对酶切电泳结果进行辨读时,HAL~NHAL~N基因型表现出493bp和166bp两条电泳条带,HAL~NHAL~n基因型表现出659bp、493bp和166bp三条电泳条带,HAL~nHAL~n基因型只出现659bp一条电泳条带。最终对所获得的氟烷基因片断进行序列测定,进一步对酶切结果进行验证。 西藏小型猪瘦素基因研究首先采集西藏小型猪脂肪组织样本,液氮迅速冷冻后,-70℃低温保存。然后用RNAiso Reagent试剂法提取脂肪组织总RNA,用特异性引物进行逆转录反应,得到瘦素基因的cDNA序列,再用特异性引物扩增得到瘦素基因片断,测序后与人、小鼠、其他猪种的瘦素基因序列进行比对,获得西藏小型猪瘦素基因序列特征信息。 结果显示,所抽样的50头西藏小型猪个体,其氟烷基因型全部为HAL~NHAL~N,没有发现应激敏感基因HAL~n,即西藏小型猪群体内氟烷基因型的频率为HAL~NHAL~N型100%,HAL~NHAL~n型和HAL~nHAL~n型均为0.36份杜洛克猪样本中检测到4份杂合子样本,20份长白猪样本中检出1份杂合子个体,两个猪种中同样没有发现隐性纯合子个体。由此我们初步推断西藏小型猪群体内不存在应激敏感性基因,对应激不敏感。西藏小型猪瘦素基因片断序列分析的结果显示西藏小型猪瘦素基因序列与人、小鼠、其他猪种的同源性分别为89%、83%和99%。在得到的瘦素基因片断序列上发现1个位点的核苷酸突变。其编码的瘦素蛋白肽链氨基酸序列与其他猪种没有差异。


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