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15个STR基因座多态性及其在降解检材分型检验中的应用研究

刘超  
【摘要】: 短串联重复序列(STR,short tandem repeats)或称微卫星DNA重复序列(microsatellite)是广泛存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列,已广泛应用于遗传制图、遗传连锁性分析、亲子鉴定、疾病基因定位和物种多态性研究、组织移植评价等诸多领域。STR分析技术的迅速发展,使其在法庭科学领域中的作用也愈来愈大,尤其是荧光标记STR复合扩增技术和全自动DNA测序仪的结合使STR分析结果数字化、标准化,且一次扩增可多达16个基因座,累积个体识别力达到DNA指纹的认定水平。STR检验极大地拓宽了法医物证检验范围,直接推动了DNA犯罪信息数据库的发展。已成为法庭科学最直接、最重要的物证鉴定手段。每年就有数以万计的DNA鉴定结论被法庭采用,在打击犯罪中发挥越来越重要的作用。 尽管荧光标记STR复合扩增及其在法医学中的应用自1999年开始已有报道,目前该技术已成为我国法医物证检验的主导技术,并成功地应用于各种案件的鉴定。但不管是基础研究还是实际应用,都还有许多方面有待进一步研究,表现在: 1.群体多态性:多态性频率资料是准确计算法医学应用参数、评估法医学应用效力的基础数据。任何遗传标记在应用于实际鉴定之前都必须对其进行准确的群体多态性调查研究。但我国有关不同人群STR基因座多态性频率资料样本量普遍较少,难以保证观察样本能够代表该群体的基因频率分布资料,且报道的频率资料多为汉族人群,缺乏少数民族频率资料,人群之间的差异性比较也不多。 2.家系分析:要分析等位基因的传递是否遵循孟德尔分离律,观察等位基因突变率,需要观察500次以上减数分裂。我国应用STR基因座作家系调查,家系数量普遍较少。 3.疑难生物检材,特别是严重降解生物检材多为一些成功的案例报道。如何发现、提取及分型检验,如何进行质量控制,一直是困扰国内外法医遗传学者的棘手问题。如前处理方法、取材部位、DNA提取及纯化方法,对STR能否分型十分重要。否则只能依赖后期检验,将降低现场检材的应用价值,对有效认定犯罪,打击犯罪十分不利。 本研究从少数民族居住地随机取样,从样本提取、基因座扩增、检测、分型到数据贮存及实际检案均用同一条件,进行标准化及质量控制;用目前扩增基因座数目最多的Identifiler系统,准确调查粤、桂、琼地区汉族及12个少数民族STR基因座多态性,计算个体识别力、非父排除率、多态信息含量、亲权概率等重要的法医学参数;通过进行实时定量和分型效果比较,对如何从现场提取腐败白骨化检材,如何进行DNA提取纯化和STR分型检验进行了系统研究;并建立了3个荧光标记mini-STR复合扩增体系。主要成果如下: 1.首次对粤桂琼地区汉族、壮族、瑶族、苗族、彝族、回族、京族、水族、毛南族、仫佬族、仡佬族、侗族和海南黎族等13个民族人群15个STR基因座进行系统的频率调查。通过13个人群共6690份样品进行15个STR基因座的分型检测,共检出191个等位基因,其中等位基因最多的是FGA,群体中最多达25个,最少的是TPOX,群体中最少仅8个。通过计算CODIS系统13个STR基因座(D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、CSF1PO、TPOX、TH01、VWA、FGA)的累积偶合率介于3.65×10~(-15)~3.06×10~(-14)、累积非父排除率(三联体)介于0.999961~0.999993、累积非父排除率(二联体)介于0.9986~0.9992,Identifiler系统的全部15个STR基因座(CODIS系统13个STR基因座+D2S1338、D19S433)累积偶合率介于7.20×10~(-18)~2.88×10~(-16)、累积非父排除率(三联体)介于0.9999952~0.9999989、累积非父排除率(二联体)介于0.99962~0.99984。 2.将调查得到的13个人群15个STR基因座基因频率资料与其他群体比较,发现调查的13个人群与中国陕西、潮汕、江苏、吉林、北京、四川、台湾等人群差异很小,而与韩国、日本人群差异较大,与莫桑比克黑人和美国白人的差距最大。这说明中华民族的不同民族间,由于战乱、通婚、自然灾害等迁移,不同民族间差异明显小于国外其他民族,而且作为系统比较,各民族间15个STR系统总个体识别力并无显著差异。但不同民族间均有一些基因座频率资料有显著差异。因此,须以不同民族、不同群体的基因频率资料计算法医学应用参数,判断其法医学应用价值。 3.通过对所测样本中检出Ladder以外的等位基因的样品进行了单基因座扩增和测序,检出目前国内尚未见报道的一些罕见等位基因,如:TH01基因座的等位基因4,D21S11基因座的等位基因30.3、32.1和33.1,D18S51基因座的等位基因15.2和27,D7S820基因座的等位基因9.1和12.1,VWA基因座的等位基因11.1,FGA基因座的等位基因13和30。发现VWA、D18S51、CSF1PO、D7S820有3个等位基因各一次。这些基因的分布频率很低(P<0.005),在亲子鉴定和个体识别中有重要意义。 4.对15个STR基因座的突变率及突变本质进行了系统研究。通过观察15个STR基因座3184次基因传递,发现63个突变,涉及所有STR基因座,突变率在0.031%~0.22%之间,平均突变率为0.132%,各等位基因突变率为0~6.635%,不同基因座、不同等位基因间均存在明显差异。未发现达到或超过3个基因座的突变,仅1个家系出现2个基因座突变。提示:用STR技术作亲权鉴定须有3个基因座不符合孟德尔遗传规律才可排除亲生关系。 5.对15个STR基因座在DNA数据库中的应用效能进行了比较研究。CODIS系统13个基因座在所调查的不同民族均具有高度多态性,符合法医DNA检验基本条件,可作为我国DNA数据库建设的基因座。Identifiler系统的另2个基因座D2S1338、D19S433多态性较高,可作为DNA数据库备选基因座,检测结果也可入库。根据DP值所选的CODIS系统13个基因座中多态性最差的6个基因座(CSF1PO、TPOX、TH01、D3S1358、D7S820、D16S539),9个基因座(上述6个加D13S317、D5S818和VWA),6个STR基因座的累积偶合率介于3.29×10~(-6)~8.84×10~(-6)、累积非父排除率(三联体)介于0.9514~0.9841、累积非父排除率(二联体)介于0.8695~0.8997,9个STR基因座的累积偶合率介于1.40×10~(-9)~5.46×10~(-9)、累积非父排除率(三联体)介于0.9946~0.9992、累积非父排除率(二联体)介于0.9707~0.9797。显示,任意6个STR基因座入库比对作个体识别,任意9个STR基因座入库做亲权鉴定会影响数据库的效能。 6.对现场提取的腐败组织检材进行了系统研究。通过对毛发、指甲、软骨、白骨等共240份检材的前处理方法、取材部位、DNA提取纯化方法、DNA定量及STR分型结果进行比较研究。可见建立的方法操作性强、效果良好。结果表明,磁珠法对降解检材的分型成功率优于Chelex-100法,检出率依次为软骨、指甲和白骨。且指甲后段效果优于前段,长骨骨密质结果优于骨松质,毛发不宜作为白骨化尸体STR分型常规检材。将本方法应用于实际案例512宗,9个STR基因座以上分型成功率可达93.33%。 7.建立了三个miniSTR复合扩增体系。体系1包含CSF1PO、TPOX、TH01和Amelogenin基因座;体系2包含D8S1179、D16S539、D5S818基因座;体系3包含D13S317、D7S820、VWA基因座。建立了第二、第三个miniSTR复合扩增体系同步扩增方法,通过对第二个体系正向引物的5′端进行荧光标记、第三个体系用荧光素和生物素分别标记正向和反向引物的5′端,将亲和素连接于磁珠上,应用链霉亲和素磁珠使两个复合扩增体系的PCR产物得到有效分离。显示miniSTR复合扩增体系可以更有效地应用于降解检材的STR分型。建立的miniSTR复合扩增体系特异性好,灵敏度高,具有良好的数据库兼容性,对降解DNA样品的STR分型有效,具有良好的法医学应用前景。 总之,本研究对准确计算粤桂琼地区-13个人群15个STR基因座法医学应用参数,扩大犯罪现场检材的检验范围,提高降解生物检材STR检验的成功率,建立降解生物检材DNA检验技术标准,对进一步提高DNA数据库的应用效能和筛选基因座研发新的STR检验试剂均有十分重要的意义。


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