保肝宁对leptin刺激HSC的增殖及其JAK_2-STAT_3信号通路影响的实验研究

【摘要】： 研究目的 观察中药复方保肝宁对外源性瘦素(leptin)刺激的肝星状细胞(Hepatic stellate cell，HSC)增殖功能的影响及其对蛋白酪氨酸激酶(Janus Kinase，JAK)-信号转导子和转录激活子(signal transducer and activator of transcription，STAT)信号转导通路中相关信号因子：OB-Rb、JAK_2、STAT_3及其磷酸化蛋白的影响，试图进一步阐明保肝宁抗肝纤维化的可能机制。 研究方法 一、药物血清的制备：给正常20只Wistar大鼠随机分组，每组5只，采用血清药理学方法，分组给予保肝宁(由黄芪、桃仁、丹参、黄芩、鳖甲、柴胡、白芍、枳实等组成)等剂量煎剂(1.77g／ml)，保肝宁二倍剂量组煎剂(3.54g／ml)，秋水仙碱(0.05g／ml)灌胃7天，正常对照组大鼠给予生理盐水，常规方法制备含药血清及正常大鼠血清。 二、细胞培养：HSC-LX2以含10％胎牛血清的RPMI-1640培养于含5％CO_2、饱和湿度的37℃环境中。每2天传代1次。分组给予药物血清培养基以及正常大鼠血清培养基培养细胞。 三、应用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测HSC-LX2在6、12、18、24h时分泌的leptin的剂量。 四、应用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolylium，MTT)比色法检测0，10，50，100，200及400ug／L的leptin在6，12，18，24h对HSC-LX2增殖的影响及保肝宁对HSC-LX2增殖的阻断作用。 五、应用蛋白印迹试验(Western blotting analysis，WB)检测保肝宁对leptin刺激HSC-LX2 6、12、18、24h后的OB-Rb、JAK_2、STAT_3及其磷酸化蛋白的表达水平。 结果 一、用ELISA法研究不同时间组HSC在培养48h时上清液平均leptin浓度的结果经单因素方差分析显示：F=271.363，P=0.000，组间比较采用LSD法，12、24、36、48hHSC分泌leptin的浓度之间比较有显著性的差异(P=0.000)，可见HSC分泌leptin的浓度随增殖时间的递增而减少。 二、用MTT法研究不同浓度的leptin在不同时间对HSC增殖的影响结果，经重复测量数据的方差分析显示：F=193917.2，P=0.000，同一时间，与对照组相比较，leptin 10ng／ml组有差异(P=0.031)，其余各浓度组有显著性差异(P=0.000)；leptin 10ng／ml组与leptin 50ng／ml组比较无显著性差异(P=0.300)，leptin 200ng／ml与leptin 400ng／ml组比较无显著性差异(P=0.391)；leptin 100ng／ml组与leptin 10ng／ml比较有显著性差异(P=0.001)，与leptin 50ng／ml组(P=0.009)、leptin 200ng／ml组(P=0.012)、leptin 400ng／ml组(P=0.028)比较有差异。这表明leptin剂量为10-400ng／ml时，对HSC-LX2的促进增殖作用呈现剂量依赖性。而不同时间同一剂量组HSC-LX2增殖OD值(570nm)比较有显著性的差异(F=1419.662，P=0.000)。这表明leptin剂量为10-400ng／ml时，对HSC-LX2的促进增殖作用呈现时间依赖性。 三、用MTT法研究保肝宁对HSC-LX2生长的影响结果，经单因素方差分析显示：F=22016.44，P=0.000，组间比较采用LSD法，与正常血清组比较，保肝宁等剂量组、保肝宁二倍剂量组、秋水仙碱组均能明显抑制HSC-LX2的增殖(P=0.000)；与秋水仙碱组比较，保肝宁等剂量组、保肝宁二倍剂量组明显抑制HSC-LX2的增殖(P=0.000)，但保肝宁等剂量组与保肝宁二倍剂量组间未见显著性差异(P=0.077)。 四、用WB法研究保肝宁作用HSC-LX2不同时间后OB-Rb的表达，结果显示：与正常血清组，保肝宁作用6h后，OB-Rb水平有显著的降低，12、18、24h与正常血清组差异无显著性；与正常血清组、秋水仙碱组比较，保肝宁能明显降低OB-Rb水平。 五、用WB法研究保肝宁作用HSC-LX2不同时间后JAK_2蛋白的表达，结果显示：保肝宁组作用HSC-LX2 6h后，JAK_2蛋白的表达水平开始降低，并处于最低水平，12h JAK_2的表达水平恢复至原来水平，18h、24h JAK_2的表达水平与12h JAK_2的表达未见明显差异性，亦处于原来水平，这就说明保肝宁对JAK_2的抑制作用是可逆的。与正常血清组比较，保肝宁组与秋水仙碱组均能降低JAN_2表达水平；与秋水仙碱组比较，保肝宁组更能明显降低JAK_2表达水平。 六、用WB法研究保肝宁作用HSC-LX2不同时间后P-JAK_2蛋白的表达，结果显示：保肝宁作用HSC-LX2 6h后P-JAK_2表达水平已开始降低，12h后达到最低水平，至18、24h，P-JAK_2表达水平逐渐上升，但未恢复至原来未加保肝宁组水平。我们看出，虽然保肝宁作用HSC-LX2时，P-JAK_2的表达有回升倾向，但仍未恢复至原来水平，可见保肝宁对P-JAK_2的抑制作用依然是不可逆的。与正常血清组比较，保肝宁组与秋水仙碱组均能降低P-JAK_2表达水平；与秋水仙碱组比较，保肝宁组更能明显降低P-JAK_2表达水平。 七、用WB法研究保肝宁作用HSC-LX2不同时间后STAT_3蛋白的表达，结果显示：保肝宁作用HSC-LX2 6h后，STAT_3表达水平开始降低，12h、18h STAT_3表达继续降低，至24h，STAT_3表达水平达到最低，与未加保肝宁组(0h)比较，STAT_3表达水平有明显差异。可以看出保肝宁抑制HSC-LX2中STAT_3的表达是不可逆的。与正常血清组比较，保肝宁组与秋水仙碱组均能降低STAT_3表达水平；与秋水仙碱组比较，保肝宁组更能明显降低STAT_3表达水平。 八、用WB法研究保肝宁作用HSC-LX2不同时间后P-STAT_3蛋白的表达，结果显示：保肝宁作用HSC-LX2 6h后，P-STAT_3表达水平开始降低，至12h，P-STAT_3表达水平达到最低水平，与未加保肝宁组水平比较有明显差异，18、24hP-STAT_3表达水平有所上升，但仍未恢复至原来水平。可以看出，保肝宁以不可逆之态显著抑制了P-STAT_3的表达。与正常血清组比较，保肝宁组能明显降低P-STAT_3表达水平，而秋水仙碱组差异未见显著性，可见保肝宁较秋水仙碱更有效抑制P-STAT_3的表达。 结论 一、HSC-LX2自身可分泌leptin，但分泌的lepin剂量随时间的递增而减少； 二、Leptin对HSC-LX2有促进增殖作用，呈现剂量、时间依赖性； 三、保肝宁有阻断leptin刺激HSC-LX2增殖的作用； 四、保肝宁有阻断leptin促HSCs-LX2增殖的作用，而OB-Rb的表达降低可能是其主要的作用机制之一； 五、保肝宁有阻断leptin促HSCs-LX2增殖的作用，而阻断JAK_2-STAT_3通路，磷酸化JAK_2、STAT_3蛋白表达降低可能是其主要的机制之一； 六、保肝宁有抑制leptin促HSC-LX2增殖的作用，而JAK_2-STAT_3通路被阻断，JAK_2、STAT_3蛋白表达的降低可能是其发生的主要机制之一，而这一作用主要是通过阻断leptin发生生物学效应的经典通路：JAK_2-STAT_3信号通路，降低JAK_2、STAT_3蛋白表达来实现的； 七、在本研究中，发现JAK_2、STAT_3蛋白可持续活化。