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益母草对重症急性胰腺炎弥漫性血管内凝血形成作用的研究

郑练  
【摘要】: 背景 长期以来,重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)一直是胰腺外科工作者争论和研究的热点问题,尤其对SAP合并弥漫性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)缺乏深入的研究。当出现血栓所致的多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)、出血症状明显、实验室指标出现血小板减少、凝血酶原时间(prothrombin time,PT)延长、纤维蛋白原减少、纤维蛋白降解产物升高、3P试验阳性时,DIC已经发展到了中晚期(即血小板、凝血因子消耗期或纤溶亢进)阶段,这时往往失去了治疗的最佳时机,使治疗变得困难而复杂,治愈率明显降低。故早期诊断、早期预防是DIC治疗的重要环节。 近年研究认为:SAP时,凝血激活和内皮损伤是DIC形成的关键,而DIC凝血激活反应机制中组织损伤起了非常重要的作用。SAP患者机体中白细胞过度激活、血浆中大分子增加使细胞间发生聚集;另一方面,由于炎症介质、胰酶和氧自由基、血小板活化因子、磷脂酶A_2(phospholipaseA_2,LPA_2)等损伤内皮细胞,损伤后导致组织因子(tissue factor,TF)的异常分泌,进而启动凝血过程是引起DIC的主要机制。 凝血过程是通过内源性和外源性凝血系统被激活而引起的,有相关报道,内源性凝血系统不是体内血栓形成有意义的过程,而外源性凝血系统才是体内血栓形成的重要途径。外源性凝血系统由血管壁等组织损伤后释放TF所触发,在正常情况下,内皮细胞屏障将循环血液与TF分开,当组织损伤破坏了此屏障时,TF得以与血液中的因子Ⅶ/Ⅶα结合。TF的细胞外区作为因子Ⅶ/Ⅶα的受体,X线衍射分析显示:TF与FⅦα接触的区域从TF细胞外羧基端的基底部向上延伸到其顶部的氨基端区,对FⅦα有很高的亲和力,当它与FⅦ或FⅦα形成复合物,在Ca~(2+)存在的情况激活因子Ⅹ(FⅩ)和Ⅸ(FⅨ),在启动外源性凝血途径的同时也启动内源性凝血途径,进而导致体内凝血酶的产生。而凝血酶的生成是通过自动催化和反馈机制来调节控制的,早期生成的少量凝血酶通过激活因子Ⅴ、Ⅷ和血小板,加速因子Ⅹ和凝血酶原的激活,使局部迅速生成大量凝血酶,纤维蛋白原转变成纤维蛋白,血液凝固形成血栓。由此可见,凝血过程是以TF作为启动因子激活凝血酶原的一系列反应,说明下调TF的表达可以阻断凝血过程,从某种程度上可抑制DIC的发生和发展。 动物实验研究证明,益母草(motherwort)有改善机体微循环、改善血液流变学、抗氧自由基及减少细胞内钙超负载自主作用,同时研究发现,益母草有明显的抑制血栓形成的作用。前文所述,内皮细胞释放TF在血栓形成的过程中起着重要作用,因此推测,益母草可能通过作用于血管内皮细胞,影响内皮细胞TF基因的转录和表达而阻止凝血过程。本课题通过设计以下实验来证明益母草对SAP时DIC形成的作用:(1)首先,进行人脐静脉内皮细胞(humanumbilical vein endothelial cells,HUVECs)原代培养、鉴定,并以凝血酶诱导第2代的HUVECs,观察凝血酶诱导HUVECs TF表达的情况。(2)在益母草不同浓度和不同时间的作用下,对HUVECs TF表达的情况进行分析,寻求益母草对凝血酶诱导下HUVECs TF表达的最大抑制效应所需的浓度和时间;进一步研究益母草在此浓度和作用时间对凝血酶诱导下HUVECs TF表达和TF mRNA转录的作用。(3)探讨益母草对SAP大鼠模型DIC形成的干预情况。 目的 1利用HUVECs的体外培养模型,观察在凝血酶诱导下HUVECs TF表达的情况。 2寻求益母草对HUVECs TF表达的最大抑制效应所需的浓度和时间;研究在此浓度和作用时间下,益母草对凝血酶诱导下HUVECs TF表达和TFmRNA转录的作用。 3研究益母草对SAP大鼠模型早期DIC形成的干预情况。 方法 1以胶原酶消化收集HUVECs,用F12K培养基加10%的胎牛血清进行培养,光学显微镜、免疫细胞化学方法鉴定内皮细胞,并用流式细胞仪检测细胞粘附分子CD105、CD31在内皮细胞的表达,进一步对HUVECs加以鉴定;将每条脐带分离、培养所得HUVECs分为2份,8条脐带共16份,将16份细胞随机配对分成甲、乙2组。甲组加凝血酶至终浓度25 IU/ml,培养10 h;乙组加等量磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS)培养10 h。然后采用免疫荧光法在流式细胞仪上测定TF抗原,比较凝血酶与PBS作用下HUVECsTF的表达。用配对t检验统计方法进行分析。 2把通过凝血酶(25IU/ml)作用10 h的细胞冻融液分成128份,每32份为一大组,共4组,再分别与浓度为2.5、5.0、7.5、10.0ug/ml的益母草作用;每大组再分成4小组(每组8份),益母草作用时间分别为6h、12h、24h、36h,通过免疫荧光法在流式细胞仪测定TF抗原,运用析因分析统计方法,分析益母草在不同浓度和不同作用时间对凝血酶诱导下HUVECs TF表达的作用。 3将HUVECs的细胞冻融液分成3组:凝血酶+益母草组(A组):凝血酶25IU/ml培养10 h后加益母草5.0μg/ml培养24 h。凝血酶+PBS组(B组):凝血酶25IU/ml作用10 h,再加等量的PBS培养24 h。空白对照组(C组):每步只加等量的PBS培养24 h。运用RT-PCR技术测定HUVECs TF mRNA转录和血凝检测仪自动检测活化因子Ⅶ(FⅦα)。统计方法用One-wayANOVA方差分析,如果差异有统计学意义(P<0.05),则采用SNK检验,比较两两间的差别。 4将75只Wistar大鼠随机分为5组:假手术组(SO组)(n=15):仅行开腹翻动胰腺后关腹。SAP对照组(n=15):逆行胰胆管注射5%牛磺胆酸钠制成SAP模型,术后右颈静脉注射生理盐水作为对照。DDFA组(n=15):制成SAP模型后右颈静脉注射DDFA(D:Dexamethasone,地塞米松:D:Dextran,低分子右旋糖酐;F:5-fluorouracil,5-氟脲嘧啶;A:Aprotininum,抑肽酶)。DDFAM组(n=15):制成SAP模型后右颈静脉注射DDFA+益母草。益母草组(n=15):制成SAP模型后右颈静脉注射益母草。SO组、SAP组、DDFA组、DDFAM组、益母草组分别于术后6 h、12 h、24 h,经下腔静脉取血标本检测TF、血浆抗凝血酶Ⅲ(antiprothrombin-Ⅲ,AT-Ⅲ)、血浆凝血酶原片段_(1+2)(plasma prothrombinfragment,F_(1+2))、PT,分析大鼠模型凝血功能的情况。取下腔静脉血测定血清中淀粉酶(amylase,AMY),分析益母草对SAP大鼠模型血清中AMY的作用情况。统计方法采One-way ANOVA方差分析,如果差异有统计学意义(P<0.05),则用SNK检验两两间的差别。并每组分别于术后6 h、12 h、24 h取胰腺组织行病理形态学检查。 结果 1 HUVECs生长良好,成活率高,第7天光镜下HUVECs呈铺路石改变,荧光显微镜下可见培养的HUVECs胞浆内有绿色荧光,证实其为内皮细胞,而空白对照无荧光。流式细胞仪检测HUVECs CD105和CD31表达率,CD105~+表达百分率为97.31%,CD31~+92.02%。凝血酶与PBS作用下HUVECs TF表达结果运用配对t检验进行统计学分析,t=22.69,P<0.01,两组间存在显著性差异。 2不同浓度的益母草对凝血酶所诱导的HUVECsTF表达的作用不全相同(P<0.01),益母草作用时间的不同对凝血酶所诱导的HUVECsTF表达的作用也不全相同(P<0.01),而两因素间不存在交互效应(P>0.05)。 3 A组、B组、C组3组之间TF表达的比较,F值为408.07(P<0.01),具有显著性差异,SNK检验进一步两两比较,B组的TF表达高于A组、C组的TF表达(P<0.01);TFmRNA/GAPDHmRNA灰度比值的比较,F值为48.81(P<0.01),具有显著性差异,SNK进一步两两比较,B组的TF表达高于A(P<0.01),具有显著性差异,SNK进一步两两比较,B组的TF表达高于A组、C组的TF表达(P<0.01)。 4在6 h、12 h、24 h各时间点,SO组、SAP组、DDFA组、DDFAM组、M组(以下简称5组)大鼠的血清AMY含量比较,各时间点的F值分别为86.61、114.20、241.54,P值均<0.01,SNK检验各时间点组间差别有统计学意义(P<0.01)。 在6h、12h、24h各时间点,SO组、SAP组、DDFA组、DDFAM组、M组(以下简称5组)大鼠的血浆TF含量比较,各时间点的F值分别为99.98、193.66、77.80,P均<0.01,有统计学意义,进一步两两比较显示:各时间点组间差别有统计学意义(P<0.01),6h、12h各组间TF的表达由高到低依次是:SAP组>DDFA组>M组>DDFAM组>SO组;24 h各组间TF的表达由高到低依次是为:SAP组>DDFA组>M组>DDFAM组、SO组。 在6h、12 h、24 h各时间点,5组大鼠的血浆F_(1+2)含量比较,各时间点的F值分别为37.44、36.98、113.53,P均<0.01,有统计学意义,进一步两两比较显示:各时间点组间差别有统计学意义(P<0.01),6 h、12 h各组间F_(1+2)的含量由高到低依次是:SAP组、DDFA组>M组>DDFAM组、SO组;24h各组间F_(1+2)的含量由高到低依次是为:SAP组、DDFA组>M组>DDFAM组>SO组。 在6h、12 h、24 h各时间点,5组大鼠的血浆AT-Ⅲ活性比较,各时间点的F值分别为11.94、14.80、37.26,P均<0.01,有统计学意义,进一步两两比较显示:各时间点组间差别有统计学意义(P<0.01),6 h,AT-Ⅲ活性由高到低依次是:SAP组、DDFA组>M组、DDFAM组、SO组。6h、12h,AT-Ⅲ活性由高到低依次是:SAP组、DDFA组>M组、DDFAM组>SO组。 在6h、12h、24h各时间点,5组大鼠的血浆PT比较,各时间点的F值分别为0.82(P>0.05)、1.75(P>0.05)、56.91(P<0.01),进一步两两比较显示:在24h,组间有显著性差异:SAP组的PT比DDFA组长,DDFA组的PT比DDFAM组、M组、SO组长。 结论 1 F12K培养基适合于HUVECs的培养。HUVECs在PBS的情况下可以表达微量的TF,而在凝血酶的诱导下表达大量的TF。 2益母草可以抑制凝血酶诱导下HUVECs TF的表达,而且它的抑制效应与不同的作用时间和不同浓度有关。在相同的作用时间下,浓度较低时,随浓度升高益母草对HUVECs表达TF的抑制效应增强,当浓度大于5.0μg/ml时,益母草的抑制效应不再随浓度升高而变化;在相同的浓度下,当作用时间小于24h,益母草对HUVECs表达TF的抑制效应随时间的延长而增强,当作用时间为24h,效应达到最大。所以,在浓度为5.0μg/ml、作用时间为24h的条件下,益母草对凝血酶诱导下HUVECs TF的表达抑制效应达到最强。实验结果还表明,益母草抑制凝血酶诱导下HUVECs TF的表达是通过抑制HUVECsTFmRNA的转录来实现的。 3在SAP大鼠模型中,虽然益母草不能单独控制SAP的炎症,但益母草加上SAP常规治疗可以降低TF的表达,下调SAP大鼠模型凝血系统中的F_(1+2)、AT-Ⅲ,使PT不继续延长,从而干预DIC的发生和发展。


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