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西藏小型猪心脏脂肪酸结合蛋白基因、内源性逆转录病毒基因研究

李金泽  
【摘要】: 小型猪由于其在解剖学、生理学特性、营养代谢等方面与人类极为相似,正逐步成为研究人类疾病的常用实验动物。小型猪作为实验动物已广泛应用于肿瘤、心血管病、糖尿病、外科、牙科、皮肤烧伤、血液病、遗传病、营养代谢病和新药安全性评价等领域。目前我国的小型猪品系主要有:五指山小型猪、贵州小型香猪、广西巴马小型猪、西双版纳近交系小耳猪、西藏小型猪等。我国小型猪均产于偏远山区,由此形成了封闭的小型猪群体,因而它具有遗传、表型更加稳定等优点,适用于生命科学研究。国外缺乏小型猪资源,一般采用多品种猪杂交培育,获得的小型猪体型较大、毛色多样、遗传及表型不够稳定等。 西藏小型猪是一种能够适应高原的恶劣气候和低劣饲养环境的猪种。由于自然和历史的原因,西藏小型猪保存了较为纯正的品种资源,具有与其他猪种不同的外貌特征和独特的生物学特性。一般的成年西藏小型猪体重在25~40kg之间,与普通的家猪相比,属于小型猪种,具有体型小、体质结实紧凑、皮薄、肌纤维细、肌间脂肪含量高、肉质好等特点。由于其体形小,非常适合于动物实验研究。为了把西藏小型猪培育成标准化的实验动物,南方医科大学实验动物中心2004年从西藏自治区引种50头西藏小型猪,经过四年多的培育和科学管理,西藏小型猪已经完全适应亚热带气候环境,生长繁殖性能显著提高,业已完成实验动物化培育。 本文针对西藏小型猪在畜牧学和生物医学方面的应用展开了以下的研究工作。 第一部分西藏小型猪心脏脂肪酸结合蛋白基因研究 研究背景:我国地方猪种肉质优于引入品种,这与猪肌内脂肪(intramuscularfat,IMF)含量有直接关系。肌内脂肪是影响猪肉食用品质的一个重要因素。地方品种猪IMF含量都在3%以上,高者可达6%~7%,而引入猪种的IMF一般低于3%。因对猪活体IMF含量的准确测定比较困难,即使是对肌肉样进行测定,也必须在猪达到一定的体重后方可屠宰取样,这样既浪费时间又浪费资金。再者,传统方法对猪IMF的选育存在盲目性,且周期较长。因此,寻找影响IMF含量的数量性状位点(QTL)主效基因成为人们广泛关注的焦点。国外育种专家研究发现,猪心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因是IMF的候选基因,因此,研究H-FABP基因的遗传变异对猪肉质品质的改善具有重要的实际意义。 方法:随机抽取30头西藏小型猪作为研究对象。动物清醒状态下,保定,采前腔静脉血5ml,EDTA抗凝。于-70℃低温冰箱保存。用TIANGEN公司产血液基因组DNA提取试剂盒提取西藏小型猪血液全基因组DNA,设计两对引物,分别进行两次PCR反应,将之分别命名为PCR1和PCR2,扩增产物位置分别位于5′端上游区和第二内含子。PCR1产物大小为693bp,PCR2产物大小为816bp。取5μl目的片断PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,电压80V,电泳40分钟。凝胶成像系统记录电泳结果。然后进行RFLP分析。PCR1产物用HinfⅠ进行酶切,PCR2产物分别用HaeⅢ,HinfⅠ*进行酶切。37℃反应6h,酶切产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳,80V电泳1小时。在凝胶成像分析系统下观察电泳结果并记录。PCR1所扩增的H-FABP基因片段共有4个HinfⅠ酶切位点,产生339,172,98,59,25bp5个片段,其中第1321bp处为多态性酶切位点,当此酶切位点因变异而消失时,172和59bp片段合并产生231bp的片段,定义等位基因为H(339+172+98+59+25bp)和h(339+231+98+25bp)。PCR2所扩增的H-FABP基因片段存在3个HaeⅢ酶切位点,产生405,278,117,16bp4个片段,其中第1811bp处系多态性酶切位点,当此酶切位点因变异而消失时,278和405bp片段合并产生683bp的片段,定义等位基因为D(683+117+16bp),d(405+278+117+16bp)。PCR2所扩增的H-FABP基因片段存在3个HinfⅠ*酶切位点,当3个切点都存在时,产生的酶切片段类型定为等位基因B(521+217+47+32bp),无1968位的多态切点时产生的酶切片段类型定为等位基因b(521+264+32bp)。根据测得的结果计算基因频率和基因型频率、多态信息含量,并进行基因型频率的差异显著性检验(x~2拟合优度检验)。基因频率的计算、基因型频率的差异显著性检验(x~2拟合优度检验)均采用SAS9.0进行统计分析。程序代码为自行设计。多态信息含量(PIC)的计算采用PIC_CALC软件(版本0.6,下载自生物秀) 结果:(1)在5′-上游区的HinfⅠ-RFLP位点上,西藏小型猪表现出多态性,等位基因h的频率为0.80;(2)在第二内含子内的HaeⅢ-RFLP位点上,西藏小型猪均为DD纯合子;(3)在第二内含子内的HinfⅠ*-RFLP位点上,除一头猪表现为bb基因型外,其余猪都表现为BB基因型,等位基因B的频率为0.97;(4)除HaeⅢ-RFLP位点外,在其余位点上西藏小型猪均处于Hardy-Weinberg不平衡状态。(5)在HinfⅠ-RFLP中,西藏小型猪表现为中度多态性(0.25<PIC<0.5),而在其他位点的RFLP中表现为低度多态(PIC<0.25)。 结论:在H-FABP基因5′-上游区的HinfⅠ-RFLP位点上,西藏小型猪表现出多态性,可以利用这一多态遗传标记来进一步分析其与肌内脂肪的关系。 第二部分西藏小型猪内源性逆转录病毒基因研究 研究背景:临床上,供体器官的严重短缺,使人们将目光转向了异种移植。目前为止,猪被认为是最适合的异种移植供体。但研究发现,以前病毒DNA形式整合进猪体细胞基因组中的猪内源性逆转录病毒(porcine endogenousretrovirus,PERV)在体外能够感染多种人源细胞,这引起了人们对异种移植安全性的广泛关注。PERV不能通过传统的方式如SPF化消除。中国地方猪种在地域分布、进化程度等方面存在着较大的差异,遗传多样性丰富,容易找到没有或低拷贝内源病毒序列的品种或个体,因此本项研究主要利用半定量PCR的方法检测中国的主要几种小型猪在PERV拷贝数上的差异,试图找出不含或含有较低拷贝数的一个个体或一个品种,由此培育出一个没有内源病毒威胁、适用于异种器官移植的品种或品系。 方法:抽取15头西藏小型猪。动物清醒状态下,保定,采前腔静脉血5ml,EDTA抗凝。于-70℃低温冰箱保存。用TIANGEN公司产血液基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)提取西藏小型猪血液全基因组DNA。巴马小型猪,贵州小型猪,五指山猪DNA样本由中国农业科学院畜牧兽医研究所李奎教授惠赠。获得的全基因组DNA用TE溶液溶解,稀释10倍,紫外分光光度计测定OD_(280nm)和OD_(260nm)。根据测定的OD_(260nm)值将DNA浓度调整到10ng/μl,-20℃低温冰箱保存。根据PERV基因的聚合酶区段(PERVp)设计了特征引物,使得PERVp的拷贝数就代表着PERV基因的拷贝数。共设计了四对引物,分别扩增PERVp、EnvA、EnvB、sexonlα(单拷贝基因对照)。PERVp扩增长段长度为326bp、EnvA为359bp、EnvB为263bp、sexonlα为388bp。将每个DNA样品稀释成10,5,2.5和1.25ng/μl 4个梯度,用于测定单拷贝对照和EnvA;进一步稀释成0.625,0.3125,0.15625和0.078125ng/μl 4个梯度测定PERVp和EnvB。利用Scion Image软件估测扩增片段的灰度值,假定GCAT含量相等的前提下将其矫正到300bp的灰度值。利用微软的EXCEL软件计算系列稀释后的直线斜率,各基因的斜率与相对应单拷贝基因斜率的比值既为该基因的拷贝数。结果以(?)±s表示,所有数据用SPSS13.0统计软件处理,并用one-way ANOVA检验进行组间比较,P<0.05为差异有统计学意义。 结果:贵州小型猪、五指山猪、西藏小型猪、巴马小型猪的PERV的拷贝数分别是34.12±16.96,29.38±13.83,28.71±14.11,27.12±14.43(F=0.614,P=0.609),EnvA的拷贝数分别是9.78±5.48,10.06±5.34,10.23±5.71,10.51±6.23(F=0.044,P=0.988),EnvB的拷贝数分别是24.14±11.26,20.72±8.36,18.35±8.50,17.60±8.65(F=1.512,P=0.221)。据此尚不能认为四个猪种间PERV、EnvA、EnvB的拷贝数之间的差异具有统计学意义。在所测得的几种中国小型猪中,都有EnvA和EnvB的重叠现象,即对于某些个体来讲EnvA和EnvB之和大于PERV基因的拷贝数,且在多个位点发生。五指山猪的所有个体都发生了重叠现象。 结论:与已报道的其它猪种相比,四种常用的小型猪内源病毒负载量较低,显示其用于异种器官移植研究的优越性。


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