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平行板流动腔法评价靶向微泡特异粘附效能的研究

吴爵非  
【摘要】: 目的: 超声分子影像技术(Molecular ultrasound imaging)是对粘附在血管内皮细胞上的特异分子进行靶向性超声对比成像(Ultrasound contrast imaging)。该技术应用靶向性超声微泡(Targeted microbubbles)作为示踪剂,这种靶向性超声微泡既具有与红细胞相似的流变学特征,可顺利的通过组织微循环,又可与特异性靶向分子有效的结合,从而达到特异性地评价血循环内皮细胞上分子学变化或实现检测血循环内固定的靶分子的目的。临床上有望用于评价血管内皮炎症、检测血栓形成或早期发现肿瘤等领域。实现该技术的核心就是构建有效、特异的靶向超声微泡。 通过生物素-亲和素(Avidin-biotin)桥接法构建靶向超声微泡是目前国外研究较多的方法,但国内无相关研究。此外,靶向超声微泡构建完成后其靶向粘附效能及其特异性的检测是评价靶向微泡构建成功与否的重要步骤。在体实验因体内参与靶向微泡粘附的因素较多,难以准确评价靶向微泡与靶目标的粘附效能及其特异性。平行板流动腔(Parallel plate flow chamber)技术是体外研究细胞力学行为(特别是细胞粘附)的主要手段之一,用其进行白细胞对内皮细胞粘附的研究几乎可以代替体内实验,提示平行板流动腔法有望用于体外评价靶向微泡构建效果。 本研究目的在于:1、探讨“生物素化脂质超声微泡(Biotinylated microbubbles,MBb)”的制备方法,同步探讨平行板流动腔法检测MBb制备效果的可行性;2、探讨应用生物素-亲和素桥接法制备“携羊抗小鼠IgG单抗超声微泡(Microbubbles with monoclonal antibodies against mouse IgG,MB-IgG)”,并应用平行板流动腔法体外评价自制MB-IgG特异靶向粘附小鼠IgG的能力;3、应用生物素-亲和素桥接法制备出“靶向小鼠P-选择素超声微泡(Microbubbles withmonoclonal antibodies against P-selectin,MBp)”,利用平行板流动腔模拟生理血流条件以评价其靶向粘附效能,为下一步在体评价血管内皮炎症及指导在体应用的环境范围奠定基础。 方法: 一、MBb的制备及应用平行板流动腔法评价MBb的制备效果 1、MBb的制备及理化性质鉴定 通过声振法制各出“普通脂质微泡(Control lipid microbubbles,MB)”和“表面载有生物素脂质的超声微泡(MBb)”。库尔特计数仪检测微泡的粒径分布及浓度,普通光学显微镜下动态观察微泡的稳定性;以大鼠肾脏模型评价MBb及MB的对比超声(Contrast enhanced ultrasound,CEU)显影效果;并用生物素-亲和素桥接法在其表面连接上FITC标记的链亲和素,荧光显微镜镜下观察微泡的荧光情况以确定微泡表面是否带有生物素化脂质。 2、平行板流动腔法评价MBb的制备效果 应用包被不同浓度链亲和素的聚苯乙烯培养皿作为平行板流动腔体外检测微泡粘附稳定性的平台。以包被高浓度链亲和素(50μg/ml)的培养皿观察普通脂质微泡非特异性粘附效果为对照,分别采用链亲和素高浓度包被(50μg/ml)、低浓度包被(5μg/ml)及空白培养皿检测MBb粘附稳定性,所有分组均按平行板流动腔实验说明书要求检测3个样本;采用解离实验,每30s倍增剪切应力(0.2-51.2dyn/cm~2),分别检测各组微泡达半数解离时的剪切应力。 二、平行板流动腔体外评价MB-IgG的特异靶向粘附性能 1、制备表面载有生物素化脂质的超声微泡后,采用生物素-亲和素桥接方法构建MB-IgG,库尔特计数仪检测及显微镜下观察微泡的粒径分布和浓度。 2、CEU评价MB-IgG显影效果:SD大鼠2只,进行下肢CEU,观察下肢血管成像及肌肉灌注情况。 3、用平行板流动腔评价MB-IgG特异靶向粘附性能 在以不同浓度(10ng/ml、100ng/ml和1000ng/ml)小鼠IgG包被培养皿的平行板流动腔中,MB-IgG(5×10~6/ml)经微量注射泵以固定剪切应力(0.3dyn/cm~2)通过,显微镜下观察有微泡出现后开始录像,分别检测靶向微泡在不同时间点(1、2、3、4、5和6分钟)结合于平行板流动腔中的数量,并以“1000ng/ml包被+大量羊抗小鼠IgG封闭(封闭组)”和“0ng/ml小鼠IgG包被(空白组)”,评价平行板流动腔法检测MB-IgG的靶向粘附能力。各组样本数均为3。 三、模拟生理血流条件下靶向P-选择素微泡对P-选择素的特异粘附效能 1、利用生物素-亲和素桥接法构建靶向小鼠P-选择素超声微泡(MBp),库尔特计数仪检测和显微镜下观察微泡的粒径分布及浓度。 2、平行板流动腔体外评价MBp靶向粘附效能 2.1、结合实验:MBp(5×10~6/ml)经微量注射泵以0.3dyn/cm~2剪切应力分别通过以不同浓度“小鼠P-选择素Fc段(Recombinant Mouse P-Selectin/FcChimera,PS_(Fc))”包被(10-1000ng/ml)的平行板流动腔;自显微镜下观察到有微泡出现后开始连续录像6min,观察每分钟微泡的靶向结合情况;以“1000ng/mlPS_(Fc)包被+大量抗小鼠P-选择素单抗封闭(封闭组)”和“0ng/ml PS_(Fc)包被(空白组)”为对照;在1000ng/ml PS_(Fc)包被组MBp还分别分6组以0.2、0.3、0.5、0.8、1.2和1.7dyn/cm~(2)通过平行板流动腔; 2.2、解离实验:平行板流动腔以(10ng/ml、100ng/ml和1000ng/ml)PS_(Fc)包被,流动腔内注入5×10~6/ml MBp约0.2ml后静置5分钟,先以0.9%生理盐水(极低切应力0.2dyn/cm~2条件下)冲洗掉静止但未结合的微泡,待镜下无游离的微泡后,每30s逐渐增加剪切应力,直至微泡完全解离。20倍物镜在固定的视野下全程录像、拍照。 结果: 一、MBb的制备及应用平行板流动腔法评价MBb的制备效果 1、MBb的制备及理化性质鉴定 1.1、采用声振法制备的MB及MBb在显微镜下观察均为透亮微气泡,库尔特计数仪检测MB平均直径为2.83μm,浓度为1.5×10~9个/ml,MBb平均直径为2.71μm,浓度为1.3×10~9个/ml。所有微泡静置过夜后均明显分层,保存30天后观察微泡形态及浓度无明显改变 1.2、荧光显微镜检查见生物素-亲和素桥接法连接的FITC-链亲和素荧光脂质超声微泡,大小均一、结构完整并带有均匀的绿色光环,证实微泡表面成功携带生物素脂质。 1.3、经大鼠外周静脉注射MBb及MB均能获得满意的大鼠肾脏超声显影。 2、平行板流动腔法评价MBb的制备效果 2.1、MBb可稳定结合于链亲和素包被的培养皿上,且其结合稳定性随着链亲和素包被浓度的提高而增加(F=170.777,P<0.01);对于高浓度链亲和素包被组,使MBb半数解离剪切应力为(6.4-12.8)dyn/cm~2,当剪切应力达51.2dyn/cm~2时微泡才完全解离; 2.2、MBb在没有包被链亲和素的空白培养皿上,于低切应力条件下即见明显的微泡解离,提示MBb不能稳定结合于空白培养皿上; 2.3、MB在高浓度链亲和素包被的培养皿上,于低切应力条件下即见明显的微泡解离,说明MB难以稳定结合于高浓度链亲和素包被的培养皿表面。 二、平行板流动腔体外评价MB-IgG的靶向粘附效能 1、应用生物素-亲和素桥接法成功制备MB-IgG,制备出的MB-IgG形状、大小及浓度与MBb相似; 2、经大鼠外周静脉注射MB-IgG能获得满意的大鼠下肢血流及肌肉灌注显影效果。 3、在0.3dyn/cm~2剪切应力的流体状态下,MB-IgG可与小鼠IgG包被的平行板流动腔靶向结合,而封闭组及空白组在各时间点上均未见明显靶向超声微泡结合(3-11个/视野),不同浓度实验组在各时间点上均可见不同程度的微泡结合(6-139个/视野),且包被浓度与观察时间之间存在交互作用(F=148.523,P<0.01),经重复测量方差分析后并画图显示其结合率随着平行板流动腔上小鼠IgG包被浓度的提高而增加(F=282.171,P<0.01)。 三、模拟生理血流条件下靶向P-选择素微泡对P-选择素的特异粘附效能 1、库尔特计数仪检测及显微镜下观察 显微镜下MBb为透亮微气泡,库尔特计数仪检测显示其平均直径2.71μm,浓度为1.3×10~9个/ml。制备出的MBp形状无明显变化、平均直径为2.73μm,浓度为7.1×10~8个/ml。 2、靶向微泡的结合 2.1、平行板流动腔实验显示MBp可与PS_(Fc)包被的平行板流动腔靶向结合,在血流剪切应力为0.3dyn/cm~2,MBp经过不同浓度PS_(Fc)包被的的平行板流动腔,重复测量方差分析显示不同包被浓度与观察时间之间存在交互作用(F=176.935,P<0.01),MBp结合率随着平行板流动腔上PS_(Fc)包被浓度的提高而增加(F=235.336,P<0.01),MBp几乎不能与空白培养皿结合,同样,MBp也难以与被抗小鼠P-选择素单克隆抗体封闭掉位点的PS_(Fc)结合。 2.2、PS_(Fc)包被浓度为1000ng/ml,给予6种剪切应力处理,可见MBp的靶向结合率受剪切应力影响,且不同剪切应力与观察时间之间存在交互作用(F=108.936,P<0.01),结合的微泡早期随着剪切应力增大而增加,至0.5dyn/cm~2剪切应力作用时达最大结合,但随着剪切应力继续增加,微泡结合率下降,不同剪切应力处理组微泡结合率之间比较有显著差异(F=150.364,P<0.01)。 3、靶向微泡的解离 每30s增加一次剪切应力对微泡的冲刷以观察镜下仍结合的微泡,其中PS_(Fc)包被浓度与剪切应力间存在交互作用(F=48.167,P<0.01),并可见MBp在高浓度PS_(Fc)包被的平行板更能抵抗血流剪切应力(F=297.615,P<0.01),在浓度为1000ng/ml PS_(Fc)包被的平行板流动腔中,约9.6dyn/cm~2的剪切应力方能使结合的MBp半数解离。 结论: 一、应用声振法制备生物素化脂质微泡成功,此种微泡可通过生物素-亲和素桥作用制备出携带各种靶分子的靶向微泡,为靶向超声分子成像打下基础。 二、成功建立应用平行板流动腔检测生物素化脂质微泡对链亲和素的靶向粘附效果的方法学;该方法的建立对于在体外特异性的检测靶向超声微泡对靶分子的粘附效能有重要意义。 三、应用生物素-亲和素桥接法构建携羊抗小鼠IgG单抗靶向微泡,并用平行板流动腔证实该微泡对小鼠IgG的特异靶向粘附作用,提示应用该构建方法可以在生物素化脂微泡表面添加抗体。 四、应用生物素-亲和素桥接法构建了靶向P-选择素的超声微泡成功,并用平行板流动腔体外模拟生理血流条件评价携抗小鼠P-选择素靶向微泡对小鼠P-选择素的靶向粘附效能。 五、平行板流动腔实验证实靶向微泡的靶向能力受对应靶分子的表达浓度及剪切应力影响,使用该方法验证可以得出靶向微泡在不同剪切应力下的靶向粘附能力,从而指导靶向微泡的在体应用的环境范围。


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