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X线照射原代培养大鼠海马神经元后p35、p25的表达及Cdk5激酶活性变化

韩永清  
【摘要】: 【背景】 近年来,随着生活节奏的加快和人口老龄化,恶性肿瘤的患病率在全世界范围内大幅度提高,成为继心脑血管疾病之后的人类“第二大杀手”,严重危害人类健康。 放射治疗是恶性肿瘤的主要治疗手段之一,也是部分肿瘤的根治性手段。据1998年世界卫生组织统计,全身恶性肿瘤控制率为45%,手术占22%,放疗占18%。大约有超过70%的恶性肿瘤患者有过放疗的经历。然而,射线在杀灭肿瘤细胞的同时又不可避免地造成正常组织的损伤。放射性脑损伤(radiationbrain injury,RBI)是一种由各种放疗所致的脑组织放射性反应综合征,是头颈部恶性肿瘤放射治疗后导致的严重远期并发症之一。随着肿瘤治疗水平的提高及患者生存期的不断延长,放射性脑损伤的发病率逐年上升,严重影响患者的生存质量、生存期和预后,甚至导致患者的死亡。但目前对放射性脑损伤的发病机制仍不明确,临床上也缺乏有效的治疗手段。因此,研究放射性脑损伤,探索新的治疗靶点具有重要的意义。 CDK5(Cyclin-dependent kinase 5)是脯氨酸限定性丝/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,是细胞周期素依赖蛋白激酶(Cyclin-dependent kinase)家族一特殊成员,其底物包括含Lys-Ser-Pro(KSP)样基序的MAP1b,含KSPXK的tau和KSPXX的神经丝蛋白等。与细胞周期素依赖性蛋白激酶家族其他成员不同的是,CDK5与细胞周期调节作用无关。尽管CDK5在大多数组织中表达,但是主要在神经系统中有活性,CDK5激酶激活主要限于神经系统,是因其调节亚基p35、p39特异地存在于中枢神经系统(central nervous system)中所致。CDK5在中枢神经系统发育中起关键作用,此外,CDK5参与突触功能、神经元的迁移及粘附、药物成瘾性及神经退行性变等多种神经功能调控。CDK5单独并不起作用,必须与p35、p39等调节亚基结合锚定于膜上,才能发挥作用。p35的裂解产物p25可能在调节CDK5活性中起重要作用,因为p25稳定性更高,导致持续激活CDK5,无节制地磷酸化其适宜底物。研究表明,神经元中CDK5-p25过表达导致神经元凋亡。此外,在神经元凋亡过程中,CDK5的表达及活性增加;在几种不同的模型中,抑制CDK5活性可以有效地减少神经元的坏死和凋亡。 由于CDK5活性和膜细胞骨架、粘附系统相联系,故认为CDK5在神经元内物质运输中发挥作用。通过磷酸化微管相关蛋白,CDK5可能作用于微管的动力学和轴浆运输。CDK5所致神经元细胞骨架的异常磷酸化可引起神经元的功能异常和死亡。所以认为p25可以引起CDK5异常激活,导致细胞骨架崩解和细胞内物质运输障碍,从而引发神经退变。p35裂解成p25可能是一个包括神经突起回缩,微管崩解和细胞凋亡连锁性病理反应的关键点。但是,CDK5促进细胞死亡的具体机制仍未明了。 可以肯定的是,CDK5在中枢神经系统发育及功能中起决定性作用;此外,诸多证据表明CDK5的过度激活参与神经退行性变过程。那么,CDK5异常激活是否参与RBI的发病过程,这都是值得探讨的未知数。基于此,我们用X射线30Gy单次照射培养至12天的海马神经元,用Western-blot方法检测CDK5的激活蛋白p35、p25的蛋白水平变化,然后进行抑制性干预实验,从而探讨CDK5调节异常是否参与RBI的发病过程。 【目的】研究X线照射培养大鼠海马神经元后p35、p25的表达及CDK5激酶活性变化,为放射性脑损伤的预防和治疗提供理论依据。 【方法】 (1)以培养至第12天的大鼠海马神经元为实验对象,用30Gy X射线单次对其进行照射。 (2)分别在照射后3.5h、4h、5h、6h共4个时间点,用Western-blot检测CDK5的调节亚基p35、p25蛋白水平。 (3)在照射后24h,用DAPI染核方法检测海马神经元凋亡情况,观察CDK5抑制剂roscovitine对海马神经元放射性损伤的作用。 (4)实验数据根据计量资料以均数±标准差((?)±s)表示,使用SPSS13.0软件进行统计分析。设检验标准α为0.05。 【结果】 (1) Western-blot实验结果显示:p35(35KD)于照射后增加,差别有统计学意义(F(4,15)=19.338,P=0.000,N=4);照射后3.5h组与对照组比较相比增加1.52倍,差别有统计学意义(P<0.001),照射后4h组增加量为对照组的1.44倍,差别有统计学意义(P<0.001)。p25(25KD)表达水平亦于照射后增加,差别有统计学意义(F(4,15)=6.617,P=0.003,N=4);照射后6h组与对照组相比增加1.63倍,差别有统计学意义(P<0.001)。p35、p25表达水平的改变提示在X线照射原代培养海马神经元后,可能存在CDK5活性增加。 (2)凋亡实验显示:在照射前15min用CDK5抑制剂roscovitine(10μM)孵育原代培养海马神经元,可以部分保护照射诱导的海马神经元死亡(F(2,13.121)=146.226,P=0.000,N=9)。30Gy组在照射后24h核固缩百分数为(24.8%±3.97%),较OGy组(1.82%±1.08%)有显著性差异(P<0.001);30Gy+roscovitine组在照射后24h核固缩百分数为(7.74%±2.27%),较30Gy组有显著性差异(P<0.001),亦较OGy组有显著性差异(P<0.001)。 【结论】 (1) X线照射培养海马神经元后p35、p25蛋白表达增加,可能异常激活CDK5; (2)应用CDK5抑制剂roscovitine抑制CDK5活性可以显著减少X射线诱导的海马神经元死亡,提示CDK5异常激活可能参与放射性海马神经元损伤过程。


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