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雪旺氏细胞共培养对成肌细胞基因表达谱的影响

李晋  
【摘要】: 随着骨骼肌相关疾病如骨骼肌损伤,肌营养不良,肌萎缩和肌肥大等的发病率越来越高,有关骨骼肌损伤后修复、再生和重建的细胞和分子水平的机制研究日益受到研究者的高度关注。应用组织工程学原理和技术方法研究复合型的骨骼肌重建,进而修复肌损伤,是一种创新的研究。 成肌细胞(Myoblast)由骨骼肌卫星细胞(Skeletal satellitecell)分化而来,来源于胚胎的中胚层细胞,在胚胎的发育过程中不断增殖、分化为成熟的骨骼肌组织,成肌干细胞以肌卫星细胞形式存在于肌纤维的肌膜和基底膜之间。生理状态下,肌卫星细胞以静止未分化状态存在,骨骼肌受到损伤时肌纤维开始坏死,巨噬细胞吞噬坏死细胞和肌纤维基底膜,此时肌卫星细胞激活分裂为纺锤形的成肌细胞,相互融合为肌管,发育形成再生肌纤维。雪旺细胞(schwann cells,SC)是周围神经系统的胶质细胞,包绕周围神经轴突形成有髓或无髓神经纤维。SC能够分泌表达数种神经营养因子;防止受损神经元胞体的死亡;促进轴突髓鞘化,从而促进损伤的周围及中枢神经系统再生等。当周围神经肌肉损伤时,雪旺细胞增生活跃并分泌释放大量的神经营养物质以促进神经再生并参与维持正常骨骼肌的形态和功能以及损伤肌肉和神经的修复。体外培养的成肌细胞受睫状神经营养因子或神经提取液刺激后增殖迅速,肌小管的融合率明显提高,表明神经因素对成肌细胞的增殖、分化有促进作用。为更接近临床应用,组织工程化人工肌肉将逐步从单一肌细胞三维培养向神经、血管与肌肉复合型的肌组织构建过渡。随着对肌肉损伤修复过程的分子机制了解深入,SC被视为重要的影响因素参与到肌肉再生的过程中。然而,雪旺氏细胞对成肌细胞的生物学影响虽已有研究证明,但涉及到的成肌细胞基因表达变化尚没有过多了解。因此深入研究SC对成肌细胞转化时的基因表达变化,将促进神经组织工程的发展,为复合型的骨骼肌重建提供理论支持。 本课题立足于实验室前期的相关工作:雪旺细胞培养于与骨骼肌支架相连的管状支架上,构建带雪旺细胞索的组织工程化骨骼肌。但成肌细胞与雪旺细胞间的相互调节的分子机制不明,限制了该工作的延续。 本实验首先获取原代培养的大鼠雪旺氏细胞,再与成肌细胞系L6共培养,通过细胞计数及倒置显微镜观察细胞增殖与分化情况。数据显示与雪旺氏细胞共培养的成肌细胞在增殖初期与对照组无明显差异,至第三天共培养后表现出对数生长期的时间,明显早于对照组。处理组的肌管形成率也较对照组为多。肌动蛋白的检测,在第3天第5天两个观察时间点,处理组细胞已出现高表达,明显强于对照组细胞。以上数据说明雪旺氏细胞的参与能够有效的促进成肌细胞增殖及终末分化。 为加深对共培养导致成肌细胞形态学改变的认识,本实验还采用全基因组基因芯片进行检测,研究SC对成肌细胞影响过程中的基因谱表达变化,以明确在诱导分化过程中,涉及到哪些基因的表达变化以及哪些代谢过程的改变。在处理组与对照组的细胞所获RNA质量保证的前提下,纯化标记后与全基因组基因芯片进行杂交。杂交后的芯片经数据分析后,共筛选出显著上调基因12个,显著下调基因221个。采用Panther工具对所获差异表达基因进行分析,结果表明与雪旺氏细胞共培养的成肌细胞在增殖与分化过程中涉及到多种细胞内代谢过程的改变,差异基因主要与细胞增殖与分化、信号转导、免疫与防疫、糖代谢、核酸代谢、以及钙铁离子转运等途径相关。从而提示上述细胞内代谢过程是雪旺氏共培养影响成肌细胞增殖与分化的关键。而这些代谢过程中涉及到的关键基因的表达变化则可能是成肌细胞向终末方向分化的原因所在,针对这些基因的深入探讨将有助于深入了解成肌细胞的终末分化理论,从而为以雪旺氏细胞和成肌细胞为基础的复合型骨骼肌重建等课题提供理论依据。


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