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GABA能抑制对小鼠下丘神经元时间反应特性的影响

丛文东  
【摘要】: 感觉信息在中枢的编码方式一直是感觉系统研究领域中的一个热点。听觉系统是重要的感觉系统之一,被认为是研究中枢对外在信息处理机制的理想模型。声音信息的编码机制在对听觉功能和机制的研究中占重要地位,但频率和声强作为声音的两个基本参数,其编码机制尚不明确。传统观念认为动作电位发放数(率)编码了声音参数。近十几年来,动作电位的产生时间,尤其是第一动作电位潜伏期(first spike latency,FSL),由于其可能携带的大量感觉信息,引起了越来越多的关注。在听觉系统研究中,FSL通常定义为从声音刺激的开始到第一个动作电位发放出现之间的时间间隔。本实验室前期研究确定了FSL表征声刺激强度和频率远较动作电位数(率)更为稳定、准确,并表现出高度的同一性。因此我们有必要对FSL的产生机制、影响因素进行深入研究。 哺乳动物中脑下丘作为听觉系统的重要中继核团,在时空信息编码及时空整合中扮演重要角色。下丘神经元接受兴奋性和抑制性输入。其抑制性输入主要为γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA)能和甘氨酸(glycine,Gly)能。离子微电泳GABA和Gly拮抗剂荷包牡丹碱、马钱子碱可改变下丘神经元的声反应特征。此类研究多集中在蝙蝠上,主要以动作电位数为观察指标,而对FSL影响的报道很少。下丘不仅接受听觉通路上行传导纤维也接受离皮层的下行传导纤维。下行传导纤维来自听觉离皮层系统,即起自听皮层直接和间接投射到皮层下听觉核团甚至耳蜗的下行纤维。离皮层系统可改变下丘神经元的声音反应特性,如阈值、最佳响应频率等。但离皮层系统是否影响下丘神经元FSL和时间反应特性尚未见相关报导。 我们实验室的前期研究表明,神经元FSL主要由传递延时和效能延时两部分组成。传递延时也称最小延时,不因刺激强度改变而变化,包括声刺激传递到内耳毛细胞声传延时、沿轴突传递的动作电位传递延时,以及经突触的固有传递时间。而效能延时是因刺激强度而改变的延时。本实验采用BALB/c小鼠,用在体细胞外方法记录下丘听觉神经元对声音刺激的时间反应特性,并比较下丘微电泳荷包牡丹碱(BMI)和听皮层给予BMI后下丘神经元时间反应特性改变,以期解决以下三个主要问题:1、GABA抑制作用是否参与了下丘神经元FSL形成,GABA作用的环节在哪里;2、FSL的变化对信息表征的意义;3、听觉下行传导通路是否影响下丘神经元FSL。 细胞外记录在隔音防回声的屏蔽室内完成。先将置于自制的塑料泡沫模子中的BALB/c小鼠悬挂在防震台的支架上,接着以固定在颅顶平面长约1.5 cm的平头金属钉固定动物头部。而后在下丘部位头骨钻孔,剥离硬脑膜,暴露下丘表面。被用于研究下行通路作用的小鼠同时暴露同侧听皮层。分别以多管和单管微电极进行在体细胞外记录,记录并分析局部微电泳BMI和听皮层给予BMI后下丘神经元对声刺激产生的FSL改变。 声刺激由位于实验动物头部正前方30 cm处的扬声器发出,为自由场给声方式。所有声音信息都是由三个基本参量构成,即声刺激的频率、强度和时长。本实验采用相当于只刺激某一基底膜部位的纯频声刺激,即单一频率声音,其幅度由包络波控制。包络波分为上升部分(起始部分,onset)、稳态部分(steady-state)和下降部分(结束部分,offset)。实验室通常经以下参数控制声刺激包络波:上升时问(rise time,RT)、上升函数(rise function,RF)和下降时间(falltime,FT)及下降函数(fall function,FF)和稳态声强(即最大声强,steady-statepressure,SP)。我们将声音包络波参数设定为时程50 ms,上升和下降时间分别为20和5 ms,上升函数为余弦平方函数。以上声音参数通过Trucker-DavisTechnologies系统3来编辑,通过计算机用BrainWare软件控制和改变刺激强度和频率。 声刺激诱导神经元产生动作电位。信噪比大于4:1的电信号视为动作电位,具有相同波形特性的动作电位确定为单单位。单单位动作电位被认为来自于单个神经元。确定单个神经元反应后,通过改变短纯音刺激的频率和强度(频率-强度扫描),记录神经元对声刺激的频响特性。以动作电位数(率)为指标,确定该神经元的特征频率(characteristic frequency,CF)和最小阈值(minimumthreshold,MT)。最小阂值是神经元对30%相同声刺激产生反应的最小声刺激强度,特征频率是神经元对最小声刺激强度产生反应时的声刺激频率。然后,在下丘神经元局部微电泳GABAA受体拮抗剂BMI和听皮层给予BMI,再重复频率-强度扫描。记录数据后,离线计算神经元对相同声刺激产生动作电位的平均FSL。分别以动作电位数和FSL为指标,分析局部微电泳BMI和听皮层给予BMI对下丘神经元声反应特性的影响,从而确定GABA抑制作用和听觉下行传导通路对下丘神经元FSL的影响及其影响成份,并进一步阐明FSL变化的生物学意义。 实验共记录到88个下丘神经元反应。神经元特征频率分布在7.5-38 kHz,最低阈值范围10-80 dB SPL,最低阈值与特征频率之间没有特定关联。下丘神经元的频率调谐曲线主要为V型,其次为U型,另有少量的多峰型和宽带型。在浅麻醉状态下,下丘神经元自发放电很少,神经元的动作电位发放模式分为相位型(phase)、相位紧张型(phasic-tonic)、准紧张型(quasi-tonic)和紧张型(tonic)四类。以动作电位发放数为指标,神经元对某一纯音反应的发放数-强度曲线分为非单调型(non-monotonic)、单调型(monotonic)、饱和型(saturate)三种类型,且同一神经元对不同频率声刺激可呈现不同的反应类型;神经元对某一强度下不同频率声刺激的发放数一频率反应曲线虽总体呈现倒V型,但变异性较大。而以FSL为指标时,神经元对不同频率反应的FSL-强度曲线只表现为潜伏期随声强衰减而单调延长的特性;神经元对不同强度下的FSL-频率反应曲线呈V型或W型,神经元的最小潜伏期总是对应于特征频率。这种反应特性表明潜伏期对声刺激强度和频率表征更稳定和准确。神经元对不同频率反应的FSL-强度曲线,可由心理物理学上Pieron法则来描述:y=A_i×e~((-x/ti))+y_0i,其中y为神经元对声刺激反应的FSL,x是用dB SPL表示的刺激声音幅度,y_0,A,t为三个拟合常数。y_0是当X轴声强接近无限时曲线上的延时,即最小延时(MFSL),i代表不同的频率。实验结果表明,声刺激的频率不同,yo,A值不同,而t却不受刺激频率的影响;不过不同神经元其t值不同。 88个下丘神经元中有38个进行了局部微电泳BMI实验。微电泳BMI后,97.4%(37/38)的神经元发放数增高,动作电位发放类型多由相位型转变为相位紧张型和紧张型。大多神经元(30/38)特征频率不改变,有8个神经元的特征频率发生漂移,偏移幅度在±0.5-3kHz间。特征频率偏移与神经特征频率间没有关联。22个(57.9%)神经元最小阈值下降,12个(31.6%)神经元最小阈值不变,4个(10.5%)神经元出现最小阈值上升;微电泳BMI所致的最小阈值变化与神经元最小阈值呈一定线性关系(y=-0.3138x+5.8495 R~2=0.3492)。最小阈值小(20 dB SPL)的神经元,其最小阈值增高,最小阈值大(20 dB SPL)的神经元,微电泳BMI降低其最小阈值,而且最小阈值越大其变化幅度也大;通常神经元对非特征频率反应的阈值改变较特性频率的大。38个下丘神经元最小潜伏期范围在9.62-34.13(15.39±5.62)ms。微电泳BMI使27个神经元FSL缩短、8个神经元FSL延长,3个神经元FSL不变。给药后FSL-强度曲线经水平或/和垂直移动可与给药前FSL-强度曲线重合,表明微电泳BMI并不改变神经元的FSL-强度反应特性,即曲线斜率。垂直移位代表MSFL改变,水平移位代表神经元最小阈值变化。特征频率改变的8个神经元中,6个神经元曲线垂直移位,即MFSL改变;而特征频率未变的30神经元中,有25个曲线只呈水平移位,即微电泳BMI只改变了神经元阈值。基于上述结果,我们得出结论,GABA参与小鼠下丘神经元FSL形成,从FSL-声强曲线变化关系可以推断阻断GABAA受体可以改变最小阈值和MFSL,即信息传递与整合的突触效能和突触群。由于MSFL改变往往伴随神经元特征频率的变化,因此本研究结果还提示,深入研究MFSL与特征频率的变化关系,不仅可完善听觉中枢的时间编码原理,还可能阐明听觉中枢时间编码声刺激频率特性的机制。 下丘神经元接受离皮层系统的广泛调节作用。我们给予小鼠听皮层荷包牡丹碱,观察了皮层神经元GABA_A受体阻断下对下丘神经元反应潜伏期的影响。88个神经元中有25个神经元进行了离皮层作用研究。在皮层荷包牡丹碱作用后,下丘神经元动作电位发放数减少或不变;神经元的最小阈值变化则以上升和保持不变为主,分别占神经元总数的52%(13/25)和44%(11/25);FSL延长的神经元有16个(64%),FSL缩短的神经元有3个(12%),FSL不变的神经元有6个(24%)。FSL对声强的表达关系仍为FSL随声强衰减而单调延长,FSL与频率关系仍为特征频率下FSL最短,偏离特征频率越远FSL越长。因此,可以推断皮层神经元GABAA受体阻断后对下丘神经元主要起抑制作用,但不改变FSL对声强和频率的表达关系。


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