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免疫清零驯化治疗免疫性肌炎动物模型的研究

邹纬  
【摘要】: 研究背景与目的 自身免疫性疾病(Auto-Immune Disease,AID)包括多种、多系统疾病,多系统器官都可被累及。AID具有病情反复、迁延不愈、逐步恶化的特点。 AID的免疫异常机制包括: 1,自身反应性淋巴细胞逃避“克隆丢失”,也即逃避了阴性选择的过程,进入外周,可针对相应自身抗原产生应答,引起AID。 2,淋巴细胞突变,抗原识别能力异常,对自身抗原产生免疫应答,引起AID。 3,淋巴细胞旁路活化,绕过耐受的Th细胞而直接或间接地激活静止的效应细胞,导致AID的发生。 目前治疗AID方法,包括: 1,单用或联合使用糖皮质激素(强的松等); 2,免疫抑制剂,包括中、小剂量化疗,使用环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX),环孢素A(Cyclosporine A),麦考酚酸酯(mycophenolatemofeti.MMF),弗达拉滨(fludarabine)等; 3,静脉用大剂量丙种球蛋白(Ig); 4,生物制剂,包括利妥昔单抗(rituximab),抗TNF-a单抗(英利昔,infliximab),合成蛋白,如CTLA4-Ig融合物,hCDR1(人CDR1合成肽)等; 5,T细胞疫苗;补体抑制剂; 这些治疗常常仅能控制症状,但最终许多病人复发。 造血干细胞移植(HSCT)治疗也越来越多地应用于难治性自身免疫疾病的治疗,并产生了令人鼓舞的效果。其原理为通过大剂量化疗或全身照射摧毁患者的免疫系统,以达到清除异常免疫应答,缓解自身免疫性疾病的作用,继而以移植的自体或异基因干细胞输入重建正常的免疫系统,在免疫重建的过程中以免疫调节药物诱导对自身抗原的耐受。但由于移植相关的死亡、复发以及异基因移植后移植物抗宿主反应(Graft-Versus-Host-Disease,GVHD)等并发症的发生限制了HSCT在临床的应用。 自身免疫性疾病反复发作的原因包括:病变在干细胞水平,重建自身免疫系统后病变依旧导致复发;变异的免疫细胞克隆未能完全清除或在回输自体骨髓细胞时异常克隆重回体内导致复发;变异体细胞(如被病毒感染的细胞)依然存在,自体移植后新生的免疫细胞再次对其攻击导致复发。 干细胞水中的病变,必须通过异基因造血干细胞移植方能治愈。异反应克隆的残留和自体骨髓回输导致的异反应克隆回输,可以通过强化免疫清除而不回输自体骨髓细胞办法来解决。而变异体细胞持续存在,自身免疫系统对其持续攻击导致的复发,通过诱导免疫耐受方法治愈是可能的途径之一。 基于以上知识,结合现有的临床经验,我们形成了免疫清零驯化治疗的理论,诱导新生免疫细胞对异己体细胞(含变异体细胞)产生耐受是本治疗方法的关键。 异基因HST时干细胞分化成免疫细胞后或移植物中含有的成熟免疫细胞在受者体细胞抗原刺激下产生排斥反应发生的移植物抗宿主疾病(GVHD)是最好的AID模型。如果在干细胞输入同时开始使用CsA等药物能阻止多数同胞HLA相合移植的GVHD,且无须终生服用免疫抑制药物。在HLA配型不相合移植中,如果清除了成熟T细胞,在CsA等药物作用下同样能阻止多数GVHD的发生。这一事实说明:CsA等药物能诱导从干细胞分化来的初生免疫细胞对体细胞的耐受。因此,我们假设: 1,AID时体内细胞变异是永久存在的,且这些变异的体细胞引起体内持续的异常免疫反应,从而导致AID; 2,外界因素导致异常克隆免疫细胞的产生。 故,借鉴HSCT清除免疫系统的方法,先用免疫清零,继之以诱导新生免疫系统对变异体细胞产生耐受,同时最大限度地保护自体造血干细胞,即可能治愈除干细胞病变以外的AID。 使用不同的自身免疫性疾病模型进行免疫清零驯化治疗的研究也有助于深入研究各种自身免疫性疾病的发病机制。本研究我们选择免疫性多发性肌炎动物模型作为研究对象。 免疫性多发性肌炎是多种病因引起的以骨骼肌间质性炎性改变和肌纤维变性为特征的综合征,病理改变为骨骼肌纤维广泛破坏和单核细胞、淋巴细胞浸润、临床表现为对称性肌无力和肌瘤。 免疫性肌炎发病机制的研究已有很大进展,研究证实其发病机制与T淋巴细胞介导的细胞毒性致肌细胞破坏、补体介导的微血管病变以及患者体内存在的自身抗体等有关的多种事实均支持多发性肌炎是一种自身免疫反应所致的炎症性肌炎病变,并发现多发性肌炎主要与细胞免疫有关。与大多数的自身免疫性疾病相似,多发性肌炎病程漫长,容易复发,如何才能治愈一直是医学界难题。 PM的病因有三种主要理论:免疫、感染、遗传。但目前更多的研究认为PM是一种自身免疫性疾病,且以细胞免疫为主。也有研究发现PM的肌组织有血管周围炎,提示体液免疫也对其发病起重要作用。研究证实CD8+T细胞的细胞毒作用受HLA-I类抗原的影响,肌炎患者肌纤维中HLA-I的表达增强。近年来也有研究发现肿瘤坏死因子(TNF)、粘附分子、趋化因子和淋巴细胞毒素都与PM的发病有关,更证实了PM是一个免疫性疾病。 多发性肌炎越来越受到认同的自身免疫发病机制让我们决定选择PM作为免疫清零驯化治疗自身免疫性疾病的实验动物模型。 方法 1、建立免疫性多发性肌炎的动物实验模型。 制作家兔肌肉匀浆,调整蛋白浓度约45mg/ml,与完全弗氏佐剂以2:1的比例彻底混匀。造模动物为36只健康豚鼠,以肌肉匀浆混悬液给豚鼠进行项背部皮下注射,每周一次,共六周。造模前后检测豚鼠相关血液学指标,造模过程中抽检豚鼠肌肉病理。对造模前后相关血液学指标进行重复测量因素方差分析,明确造模成功。 2、以免疫清零驯化治疗方法治疗免疫性多发性肌炎实验动物模型疗效观察。 选造模成功豚鼠28只,随即分组,一组7只,共四组。各组基础资料进行统计分析,明确各组在治疗前各指标无显著差异。所有动物于零天开始予腹腔药物注射。 超大剂量免疫清零驯化组予白消安1mg/kg(豚鼠剂量5.5mg/kg),每12小时一次,共8次,白消安给药结束后予腹腔注射环磷酰胺40mg/kg(豚鼠220mg/kg),每日一次,共四次,环磷酰胺给药结束后予腹腔注射环孢素A3mg/kg(豚鼠16.5mg/kg),每日一次,持续至实验结束。 常规剂量环磷酰胺组予腹腔注射环磷酰胺10mg/kg(豚鼠55mg/kg),每日一次,共三次。 免疫清零驯化组予白消安0.8mg/kg,环磷酰胺30mg/kg,环孢素A 3mg/kg,给药次数及方式同超大量免疫清零驯化组。 对照组为空白对照。 所有动物给药前已进行全血细胞检查及生化检测谷草转氨酶(AST),肌酸激酶(CK)及乳酸脱氢酶(LDH)检测,测量体重,所有动物在给药+7天采血行全血细胞分析,实验结束时采血行全血细胞分析及生化检测。在此前死亡动物于死后立刻采血及行肌肉组织病理检查。实验结束时所有动物采血并各组抽样动物行肌肉组织病理检查。 统计学方法: 本实验数据应用SPSS13.0统计软件进行处理,对造模数据使用单因素重复测量因素方差分析,给药前基础数据用ONE-WAY ANOVA进行处理,给药前后治疗效果数据使用重复测量因素方差分析,使用Kaplan-Meier生存分析给药后生存率,并进行log-rank检验、breslow检验及Tarone-ware检验,绘制生存曲线。以p≤0.05表示差异有统计学意义。 结果: 1,单因素重复测量方差分析显示豚鼠造模前后肌酶谱检测CK及AST的升高均有显著意义,白细胞计数有显著增加,兔肌肉匀浆完全弗氏佐剂混悬液免疫六周后造模成功。 2,选择28只造模成功豚鼠随机分组,单向方差分析显示给药前基础资料各组之间无显著差异。 3,重复测量因素方差分析显示超大剂量免疫清零驯化治疗组和免疫清零驯化治疗组给药前后CK、AST有显著差异,给药后CK、AST有显著下降。 3,给药后超大剂量免疫清零驯化治疗组和免疫清零驯化治疗组血细胞计数显著降低,超大剂量治疗组的外周血淋巴细胞、中性粒细胞下降尤其显著。 4,常规剂量环磷酰胺组和对照组给药前后CK、AST、LDH均无显著变化,常规剂量环磷酰胺组给药前后血象变化显著。淋巴细胞计数有显著降低。 5,Kaplan-Meier生存分析见超大剂量清零驯化组平均生存时间(8.143±0.857天)、生存中位时间(8天)与其他各组比较存在显著差异,常规剂量环磷酰胺组(生存时间11.429±0.297天;生存中位时间12天);与对照组(生存时间10.428±0.369天;生存中位时间10天)相比无显著差异,清零驯化组平均生存时间(15.286±0.68天)及生存中位时间(16天)明显优于其他各组。 结论: 1,以家兔肌肉匀浆加完全弗氏佐剂反复免疫豚鼠六周,免疫后豚鼠血清CK、AST显著高于免疫前,病理学检查显示肌肉组织可见肌炎表现,造模成功。 2,免疫性肌炎模型动物随机分组后分别给予不同治疗,超大剂量免疫清零驯化组白消安加环磷酰胺可达到有效清除免疫系统的效果,对肌炎相关指标的改善也有明显效果,但是对免疫性多发性肌炎实验动物模型产生损伤较重,导致实验动物生存时间降低。 3,常规剂量环磷酰胺治疗免疫性肌炎实验动物,对动物外周血细胞计数产生显著影响,但对肌炎相关指标无影响,生存时间与对照组相比也无显著差异,其对免疫性肌炎的治疗效果仍有待证明。 4,免疫清零驯化治疗也可达到较理想的清除免疫系统的效果,肌炎相关指标在治疗后也表现出显著改善,而且生存时间较其他各组都显著延长。 5,总结:超大剂量免疫清零驯化治疗组及免疫清零驯化组治疗后,免疫性肌炎动物模型的肌炎相关血清学指标都有明显改善,而清零驯化组动物在治疗后的生存时间较其他诊疗方法和未治疗的动物显著延长。


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