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CRP、酶修饰低密度脂蛋白和地尔硫卓对树突状细胞成熟分化功能的综合影响

何威  
【摘要】: 冠心病是目前威胁人类健康的重要疾病,其病理基础是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS),近年来人们逐渐认识到炎症反应在动脉粥样硬化发生、发展中的重要地位。随着实验技术不断发展,越来越多的证据显示炎症贯穿了动脉粥样硬化发生、发展的整个过程。 C反应蛋白(C reactive protein,CRP)与冠心病有密切关系,血浆CRP浓度升高可以预测未来发生冠心病的危险。CRP在创伤、炎症和感染时会迅速上升,是一种急性期蛋白。临床上,CRP被作为类风湿性关节炎、血管炎等炎性疾病的诊断及治疗一种指标,同时,在自身免疫性疾病中,CRP作为部分识别分子,激活相应的免疫系统。在体外试验中,CRP表现出既有抗炎又有促炎症作用,可以促进炎症因子工L-10产生,也可以减少IFNγ;CRP通过封闭抗原表位,抑制抗体结合抗原,后者可能是抗自身免疫的机制之一,可以抵抗多种炎性因子造成的损害。 在AS发生中,LDL异常被认为起到了关键的作用。正常的LDL不能促进炎症的发生,只有经过修饰的LDL才能刺激AS的形成。在动脉内膜下的环境有利于LDL的修饰,包括被氧化、乙酰化或是被酶修饰等,LDL被处理后成为致粥样硬化的蛋白。其中,关于氧化低密度脂蛋白(Oxidized modified LDL,xo-LDL)和酶修饰低密度脂蛋白(enzymatically modified LDL,E-LDL)研究较多。E-LDL在促炎方面的因素可能较为重要。 E-LDL是致粥样硬化的重要因素。用胰蛋白酶、胆固醇酯酶、神经酰胺酶作用于LDL可以得到酶修饰的LDL。蛋白酶降解脂蛋白apoB100,使胆固醇酯酶作用于暴露出来的脂类,释放出游离脂肪酸,增加了胆固醇的含量,与细胞外基质紧密结合。E-LDL与巨噬细胞上的清道夫受体结合,促进巨噬细胞内吞LDL,有效诱导巨噬细胞转化为泡沫细胞,同时,酶处理后的LDL可以融合成大的LDL颗粒,激活补体,这种作用与氧化型LDL无关。E-LDL的沉积伴随大量的MCP-1、IL-6和少量IL-1β或TNF-α等细胞因子产生。这些因子在粥样斑块形成过程中可能起了重要作用。用单克隆抗体结合各种LDL证实在动脉粥样早期损伤处存在E-LDL而不是ox-LDL或天然LDL。 CRP与E-LDL在早期损伤部位共存。且E-LDL只有与CRP结合才能激活补体。其中一个分子的CRP可以结合5个分子的E-LDL。并且可以通过巨噬细胞上的CRP受体摄取E-LDL,从而促进泡沫细胞形成。在此过程中。CRP起了重要的中介作用。CRP可以结合细胞表面的FcγRⅡα,与巨噬细胞、单核细胞表面受体结合,介导巨噬细胞、单核细胞识别及吞噬、诱导凋亡、杀伤细胞作用。 在各种炎症免疫反应中,树突状细胞(Dendritic Cells,DC)起到了重要的作用。DC是目前发现的功能最强的专职性抗原提呈细胞(Antigen PresentationCell,APC),是机体免疫反应的始动者。研究发现DC在AS斑块中聚集增多,这也提示其免疫机制参与了AS的发生和发展。 地尔硫卓作为一种临床上常用的钙离子拮抗剂,可以阻断钙离子的内流。有研究表明,地尔硫卓可以直接诱导免疫抑制,与环孢霉素A或甲强龙联用可以调节机体的同种异体反应,在临床上有广泛使用。 在AS中DC的功能变化受多种因素影响,如LDL、CRP、各种细胞因子及钙内流。冠心病的发生及发展伴随有LDL及CRP的升高,二者对DC的成熟及分化起到了不同的作用:究竟哪一个的作用为主,有必要进行分析。此外,作为在心血管疾病中常用的钙离子拮抗剂地尔硫卓是否可以对DC的活化进行抑制,对冠心病的发展是否可以起到预防作用也值得我们进行研究。 本课题分为三个部分,首先在体外培养DC,分别用E-LDL、病理浓度的CRP或同时加入二者作用于未成熟DC,观察DC不同表面抗原的表达及其细胞因子的分泌情况,并观察DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力,了解E-LDL、CRP对DC成熟分化的影响以及二者同时作用后DC功能的变化。第二、分别用E-LDL和CRP同时作用于DC,观察加或不加用地尔硫卓后DC表面抗原的表达及细胞因子的分泌情况,并观察其刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力,了解地尔硫卓对E-LDL和CRP影响DC功能的作用。第三、建立动脉粥样硬化大鼠模型,观察主动脉斑块中DC的分布情况。比较其在有无地尔硫卓处理时的不同,来判断地尔硫卓在体内的综合效果。结果如下: 1、各组DC的CD1a、CD80、CD86表型的表达之间有显著性差异(F值分另0为3.131、7.761和4.585,P值分另0为0.037、<0.001和0.008),CRP组的CD80较PBS组表达下降,CD1a和CD86虽无显著性,但也有下降;E-LDL组的CD1a、CD80和CD86较PBS组显著升高;CRP和E-LDL同时作用于DC后,与PBS组比较,仅CD86有显著升高,与CRP组相比,CD1a、CD80、CD86显著升高,与E-LDL组相比,CD80显著下降。 各组IL-12和TNF-α表达有显著性差异(F值分别为9.610和5.035,P值为0.000和0.005)。CRP组的TNF-α显著低于PBS组;E-LDL组的IL-12和TNF-α均显著高于PBS组。CRP和E-LDL同时作用于DC后,与PBS组比较,TNF-α显著升高;与CRP组相比,IL-12和TNF-α均显著升高,与E-LDL组相比,各因子表达均无显著性差异。 各组A值间有显著性差异(F=10.422,P<0.001)。E-LDL组T淋巴细胞增殖较CRP组和PBS组显著增强;CRP/E-LDL组较E-LDL组显著减弱,较CRP组增强。 2、各组CD1a、CD80、CD86之间有显著性差异(F值分别为11.174、12.808和6.772,P分别为0.000、0.000和O.004),DIL组的CD1a、CD80较PBS组表达下降,CD86和HLA-DR虽无显著性,但也有下降;与CRP/E-LDL组相比,CD1a、CD80、CD86显著下降。 各组IL-12和TNF-α表达有显著性差异(F值分别为12.300和19.270,P值均小于0.001),IL-2和IL-6表达无显著性差异。DIL组的IL-12和TNF-α显著低于PBS组;与CRP/E-LDL组比较,IL-12和TNF-α也有显著下降。 各组之间A值有显著性差异(F=5.244,P=0.012)。DIL组的T淋巴细胞增殖显著低于CRP/E-LDL组。 3、经喂食高脂饮食并予VitD及尼古丁处理后,无论是否加用地尔硫卓,大鼠的TG、TC水平均较对照组有明显升高。高脂饮食组与地尔硫卓组之间血脂水平无显著性差异(F值分别为4.210和4.955,P分别为0.032和0.019)。 不同组主动脉上OX62表达的MOD值之间有显著性差异(F=34.913,P<0.001)。高脂饮食组和地尔硫卓组的OX62表达水平均较对照组有明显升高。与高脂饮食组比较,地尔硫卓组OX62表达水平明显下降, 通过以上实验,可以得出以下结论:1、CRP可直接抑制由外周血培养的未成熟DC的活化;E-LDL可以促进DC成熟活化;在CRP存在时,E-LDL刺激DC活化的作用可能被削弱,但此时DC功能仍较对照组有所增强,说明E-LDL的刺激作用强于CRP的抑制作用。2、加用地尔硫卓后,由E-LDL诱导的DC活化受到抑制,地尔硫卓可能通过抑制自身免疫反应的途径起到抗动脉粥样硬化和稳定斑块的目的。3、地尔硫卓对模型大鼠的血脂无明显影响。但免疫组化检测发现,AS中OX62的表达下降,说明在AS中DC的分布减少,地尔硫卓可以抑制DC在AS中的聚集。 综合了解E-LDL和CRP对DC功能的影响及地尔硫卓在粥样斑块发生过程中免疫学方面的作用,为冠心病的防治提供新的思路。


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