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环氧化酶-2抑制剂塞来昔布对人舌鳞癌Tca8113细胞侵袭性抑制作用的研究

霍秋菊  
【摘要】: 舌癌是口腔癌中最常见的恶性肿瘤之一,近年来,舌癌的发病率呈逐年上升的趋势。虽然现在舌癌的诊断和治疗水平已有很大提高,但其5年生存率仍不高,究其原因,侵袭和转移是导致舌癌治疗效果不佳和死亡的重要因素之一。由于舌体活动频繁,舌组织淋巴及血运丰富,且舌癌多呈浸润性生长,早期容易发生淋巴结转移,预后较差。随着针对舌癌发生、发展及转移机制的深入研究,特别是分子生物学研究的进展以及分子靶向治疗在肿瘤治疗中的应用,探讨与舌癌侵袭相关的因素,寻找有效、特异的抑制手段并探讨其作用机制,不仅有利于预防舌癌转移的发生,还能为临床治疗提供新的途径。 近年来流行病学研究发现,长期服用非甾体类抗炎药物(Non-steroidal antiinflammatory drugs, NSAIDs)的人群,其结直肠癌的发病率可明显降低,并可降低结直肠癌的转移率和术后复发率。NSAIDs这种抑制恶性肿瘤发生和转移的作用主要与抑制环氧化酶-2(Cycloxygenase-2, COX-2)酶的活性有关。研究表明,COX-2在包括头颈癌在内的许多组织和器官的恶性肿瘤,如结直肠癌、乳腺癌、胃癌等多种肿瘤组织中高表达,特别是在分化程度低的和伴有局部浸润或远处转移的腺癌、鳞癌组织中呈强阳性表达,在来源于相同组织类型的不同癌细胞中COX-2的表达依据其肿瘤侵袭转移能力的不同而异。有研究认为,COX-2基因过表达可促进结直肠癌细胞的侵袭和转移,COX-2基因沉默可降低结直肠癌细胞的侵袭转移能力。COX-2诱导肿瘤细胞侵袭转移的分子机制与肿瘤细胞粘附分子、肿瘤细胞膜皱褶、片状伪足形成以及细胞外基质密不可分。近来研究发现,选择性COX-2抑制剂可通过抑制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的表达及活性而抑制肿瘤细胞的侵袭能力,成为研究预防恶性肿瘤侵袭转移的热点之一。 本研究重点观察COX-2抑制剂塞来昔布对人舌鳞状细胞癌(Human tongue squamous cell carcinoma, HTSCC) Tca8113细胞侵袭的抑制作用,初步探讨COX-2及其抑制剂对人舌鳞癌细胞侵袭及转移的影响,为应用选择性COX-2抑制剂预防舌癌的发生及转移提供实验依据。 第一部分COX-2抑制剂塞来昔布对Tca8113细胞侵袭力抑制作用的研究 取生长良好的Tca8113细胞,接种于6孔培养板常规培养,待细胞铺满约70%后,做细胞划痕,再分别用0、10μmol/L的塞来昔布培养24h,通过观察迁移到划痕区的细胞情况,宏观反映塞来昔布对人舌鳞癌Tca8113细胞的侵袭能力的影响。采用MTT检测细胞活力的方法,检测塞来昔布对Tca8113细胞与细胞外基质黏附能力的影响。采用Transwell小室细胞运动实验,计数通过小室的细胞数,检测不同浓度塞来昔布作用24 h后,Tca8113细胞的体外迁移能力变化,将Matrigel胶平铺于Transwell侵袭小室底,人工重组细胞基底膜,模拟肿瘤细胞的体外侵袭过程来检测不同浓度塞来昔布作用24 h后,对Tca8113细胞侵袭性的影响。划痕实验结果显示:Tca8113细胞具有较强的侵袭能力,COX-2抑制剂塞来昔布对Tca8113细胞的侵袭具有抑制作用。细胞-基质黏附实验结果表明,随着作用浓度的增加,塞来昔布对人舌鳞癌细胞Tca8113与基质黏附的抑制作用显著增强,当采用较高浓度的塞来昔布(20μmol/L)作用细胞24 h后,Tca8113细胞对Matrigel的黏附能力明显减弱,与对照组相比差异有统计学意义(P0.01),而较低浓度组(5μmol/L)则抑制作用较弱,对照组相比,差异无统计学意义(P0.05)。细胞迁移实验结果显示,孵育24 h后,Tca8113细胞在Boyden趋化小室中迁移,较低浓度组(5μmol/L)细胞迁移数与对照组相比差异无统计学意义(P=0.052),而较高浓度组(10、20μmol/L)细胞迁移数量明显减少,与对照组相比差异有统计学意义(P均=0.000)。人工重组基底膜实验结果显示:塞来昔布组通过聚碳酸酯膜的Tca8113细胞数较对照组细胞明显减少,与对照组相比,差异均有统计学意义,塞来昔布以5、10、20μmol/L浓度作用后24 h后,透过人工基底膜的细胞数分别为132.7±6.0(P=0.073)、68.3±6.5(P=0.000)和37.7±4.5(P=0.000)。 第二部分塞来昔布通过下调节MMP-2、MMP-9表达抑制Tca8113细胞侵袭作用 取生长状态良好的Tca8113细胞常规培养24 h后,分别加入含有不同浓度塞来昔布的培养液,其药物终浓度分别为0、5、10、20、40μmol/L,培养24、48 h后,采用MTT方法测定细胞的OD值,检测塞来昔布对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖的抑制作用;不同浓度的塞来昔布作用于Tca8113细胞24 h后,提取细胞的RNA,逆转录、扩增后,经琼脂糖凝胶电泳分离,观察不同浓度塞来昔布对Tca8113细胞中MMP-2、MMP-9 mRNA的表达的影响;含0、5、10、20μmol/L塞来昔布的培养液培养Tca8113细胞24 h后,取细胞培养上清液,经明胶酶谱法(Gelatin zymography)检测不同浓度塞来昔布对Tca8113细胞培养上清液中MMP-2、MMP-9活性的影响。结果:MTT法检测结果显示,塞来昔布对Tca8113细胞的生长抑制作用随其浓度增加和培养时间的延长而增强,培养24 h后,10~40μmol/L塞来昔布对Tca8113细胞产生明显的生长抑制作用,其中40μmol/L组对细胞的生长抑制率达82.2%;作用48 h后,20、40μmol/L塞来昔布对细胞的生长抑制分别达71.7%和91.6%。RT-PCR电泳结果显示,较低浓度的塞来昔布对MMP-2抑制作用较弱,5μmol/L组与对照组比差异无统计学意义(P=0.295),而10、20 gmol/L组Tca8113细胞MMP-2表达量与对照组比差异有统计学意义(P=0.000)。对MMP-9表达量结果显示,即使较低浓度,塞来昔布对MMP-9 mRNA的表达量也有明显抑制作用,当以5、10、20μmol/L的塞来昔布处理24 h后,均可显著抑制MMP-9 mRNA的表达,与对照组相比,其表达量降低差异均有统计学意义(P均0.01)。明胶酶谱检测结果显示,10、20μmol/L浓度的塞来昔布对Tca8113细胞MMP-2、MMP-9活性均有抑制作用,且随浓度增加而增强,与对照组相比,差异统计学意义(P均=0.000)。而5μmol/L塞来昔布组,对MMP-2的活性抑制作用不明显(P=0.054),但对MMP-9的活性有明显的抑制作用,与对照组相比,差异有统计学意义(P=0.03)。 通过研究我们证实:COX-2抑制剂塞来昔布对人舌鳞癌Tca8113细胞侵袭性有明显的抑制作用,其作用机制可能与下调MMP-2、MMP-9的表达及活性有关,这对于进一步探索COX-2与舌癌的侵袭及转移的机制,以及应用COX-2抑制剂预防舌癌的转移提供实验依据。


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