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UVB相关的miRNAs的筛选及其功能的初步研究

郭玲  
【摘要】:近年来,一类叫做microRNAs(miRNAs)的非编码小RNA分子,在监控个体发育时相转变、调控特定细胞增殖、分化进程等方面起着重要作用。其在紫外线的致损伤和致病机制中的作用,逐渐被科学家们发现。通过高通量筛选miRNAs的技术平台获得UVB相关的miRNAs,是研究UVB敏感miRNAs的起点。因此,本课题采用miRNAs基因芯片筛选UVB相关miRNAs,生物信息学分析及验证其作用靶点,并探讨其在表皮癌中的作用,研究结果为探明miRNAs调控造紫外线的致损伤的分子机制、探索miRNA在表皮癌中作用提供理论指导和实验依据。 研究目的:应用miRNAs芯片筛选UVB照射的NIH3T3细胞表达miRNAs,并寻找差异表达miRNAs调控的靶基因,为进一步研究miRNAs在UVB诱导的信号传导通路中的作用打下基础;对hsa-miR-365生物学预测的靶基因NFIB/BCL2/CDK6进行实验验证,先从结构学方面来验证miRNA/mRNA的相互作用,为从功能学方面研究它们之间的关系做好了准备;研究皮肤癌A431中hsa-miR-365的表达,并探讨hsa-miR-365的抑制片段对体外生长的人皮肤癌细胞A431的抑制作用,确立miR-365与表皮癌之间的联系,为进一步研究miR-365在表皮中的作用指出新的方向。 方法:MTT法、流式细胞术和AO/EB染色检测细胞的形态学改变;运用miRNAs芯片技术筛选UVB照射的NIH3T3细胞差异表达miRNAs,同时运用miRNAs特异的引物组对差异表达的miRNAs进行荧光定量RT-PCR验证。运用靶基因预测软件预测差异表达miRNAs可能调控的靶基因,并利用DAVID Bioinformatics Resources 2008数据库将预测的靶基因进行了分析。 利用在线数据库TargetScan等预测miR-365的靶基因,在A431细胞中,Lipofectamine2000转染hsa-miR-365 inhibitor后,用real-time qPCR、western blot分别从RNA水平和蛋白水平检测BCL2、CDK6和NFIB的表达,并用psi-CHECK2荧光表达报告载体验证NFIB为miR-365的直接靶基因。 采用荧光定量RT-PCR的方法鉴定了hsa-miR-365在皮肤鳞癌A431中的表达特性,用Lipofectamine2000转染皮肤鳞癌细胞株后,进一步采用Transwell小室检测miR-365抑制后细胞体外运动能力的改变,采用Boyden小室检测miR-365抑制后细胞体外侵袭能力的改变,平板克隆形成实验和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡。 结果:MTT结果,NIH3T3细胞在受到不同剂量的UVB照射后,50J/m2的UVB其生存率为60%左右,再继续加大UVB的剂量,其生存率明显下降,故50J/m2的UVB是我们实验所选取的合适剂量。NIH3T3接受50J/m2后,继续培养不同的时间点,发现NIH3T3细胞在照射后的2h,4h,6h和12h其生存率变化显著,故我们选择这些时间点进行后面的miRNAs芯片分析。流式细胞仪分析显示:NIH3T3细胞在50J/m2 UVB照射后的12h,G1期细胞群的比例明显提高,而且出现了一个明显的凋亡峰和G1期细胞阻滞。NIH3T3细胞经50J/m2 UVB照射后继续培养12h,可见早期凋亡细胞,表现为细胞核为AO染色呈黄绿色荧光,浓聚成颗粒状;在细胞的一侧,可见细胞出芽。 miRNAs芯片结果显示,实验组细胞与对照组细胞差异表达的miRNA共30个(占11%),其中27个表达上调,3个表达下调。有趣的是,mmu-miR-365和mmu-miR-21显著上调,而mmu-miR-465在不同的时间点都下调。其差异表达均在2倍以上;Mmu-miR-let-7a, mmu-miR-24, mmu-miR-376b和mmu-miR-21的实时荧光定量RT-PCR验证结果与芯片表达结果基本一致。信号通路分析发现,miR-24参与MAPK等信号通路,miR-21参与Jak-STAT等信号通路。 利用TargetScan等多个靶基因的预测软件对miR-365的靶基因进行预测,结合GO分析,最后我们确定对NFIB、BCL2和CDK6这三个靶基因进行实验验证。在miR-365表达量较高的A431细胞中转染hsa-miR-365 inhibitor后,发现三个靶基因在RNA水平没有改变,而其蛋白水平,较对照组升高。这些结果说明,hsa-miR-365是在靶基因的蛋白水平发挥作用,而不影响靶基因的转录。将NFIB基因的3’UTR区克隆在荧光素酶报告载体psiCHECK-2的报告基因的下游,用Lipofectamine2000转染至A431细胞,DualLuciferaseTM检测荧光蛋白酶的活性,结果显示,相对于对照组,转染hsa-miR-365组的荧光素酶的表达量具有显著差异。这提示了miR-365是通过其NFIB的3’UTR发挥作用,且NFIB是其直接的靶基因。 Hsa-miR-365在皮肤鳞癌A431中表达是正常角质形成细胞的15倍,平板克隆形成实验结果显示,与空白对照组和错义转染组比较,hsa-miR-365反义片段转染的细胞增殖速度明显减慢(p0.001),流式细胞仪结果显示三组的细胞周期分布没有明显差异(p0.05)。Transwell小室结果显示,反义片段组细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数减少,差异具有显著性(p0.001)。Boyden小室结果显示,反义片段组细胞细胞的侵袭能力显著降低(p0.001)。 结论:我们的研究揭示了UVB辐射和miRNAs的联系,寻找出了在特定条件下对UVB敏感的miRNAs,这为研究受UVB调节的miRNA表达提供了基本的依据。我们进一步证明了NFIB是miR-365的靶基因,miR-365在蛋白水平抑制NFIB的表达,而不影响其转录,它们之间是通过NFIB 3'UTR相互作用的。hsa-miR-365在表皮癌细胞A431中高表达,将其抑制后显著降低了皮肤鳞癌细胞的体外迁移和侵袭能力,为研究miR-365在皮肤癌中的功能打了一定的基础。


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