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ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴对肝星状细胞胶原合成的影响及其信号转导机制研究

黄茂梁  
【摘要】: 研究背景 肝纤维化是各种原因引起的慢性肝损伤结果,是肝硬化形成的病理基础。探讨肝纤维化的发生机制及防治方法具有重要的社会价值和经济意义。尽管现已认为肝纤维化在一定情况下可被逆转,但目前尚未有公认有效的逆转肝纤维化药物,因此肝纤维化治疗一直是慢性肝病研究的重点和难点。 本课题组前期研究及近年来国内外研究表明,肝内肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)与肝纤维化形成密切相关。慢性肝损伤导致肝内RAS的各组分上调,进一步可导致氧应激、炎症细胞聚集和肝纤维化形成。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)是这个系统的主要效应成员,它能刺激肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)增殖与活化,并能释放炎症因子、生长因子以及促纤维化因子等,诱导HSC合成细胞外基质(extracellular matrix, ECM)及抑制ECM降解,导致ECM在肝内过度沉积,促使肝纤维化发生发展。近年来越来越多的证据表明,应用RAS的阻断剂可以减轻肝损伤、抑制肝纤维化形成和降低门静脉高压。 近年来,ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴的发现,引起了许多研究者的浓厚兴趣。血管紧张素转换酶2 (angiotensin converting enzyme, ACE2)降解AngⅡ并同时产生Ang-(1-7). Ang-(1-7)在体内外能拮抗AngⅡ的活性,具有舒张血管、降低血压、利尿、抑制成纤维细胞增殖等作用。此外,Ang-(1-7)还可以竞争性地与AngⅡ的受体AT1R结合,因此被认为是一种内源性AngⅡ阻断剂。由于ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴具有与经典RAS (ACE-AngⅡ-AT1R轴)相反的作用,因而被假设为具有抗纤维化作用,有可能成为肝纤维化治疗的新策略。 然而ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴在肝纤维化中的研究少有报道。目前的研究报告发现,慢性肝损伤反应促发ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴在肝内表达增强,而阻断这条轴的作用则会导致肝损害加重。然而,ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴影响肝纤维化的诸多环节尚未得到充分阐述,具体机制尚不清楚。肝纤维化的特点是ECM的合成分泌增加和降解减少,导致ECM大量沉积致纤维结缔组织增生。胶原是ECM的主要成分。HSC是产生ECM的主要细胞,HSC活化、增殖、转型和分泌胶原在肝纤维化的发生发展中起关键作用。近来对纤维化信号机制的研究表明,Smad和Rho/ROCK信号通路是新发现与RAS作用相关的两个重要途径,与胶原合成密切相关。因此,本研究将观察ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴在肝纤维化动物模型和培养细胞株HSC中的表达,探讨ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴对HSC胶原合成及Smad和Rho/ROCK信号转导途径的影响,这对于阐明ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴在肝纤维化中的作用及其机制有重要意义。 方法 1、利用四氯化碳(CCl4)造成肝中毒损伤,构建肝纤维化大鼠模型,通过HE染色法观察肝脏组织病理的改变,免疫组化方法观察ACE2在肝组织中的表达及分布,RT-PCR法检测ACE2和Mas受体mRNA的表达水平,Western blot法检测ACE2蛋白表达水平;以HSC为体外实验刺激对象,通过RT-PCR法和Western blot法,检测不同浓度AngⅡ干预时ACE2和Mas受体的表达水平。 2、应用AngⅡ与Ang-(1-7)干预HSC,及利用信号通路抑制剂阻断方法,通过Western blot法检测Smad3磷酸化表达水平,免疫荧光法观察Smad4核转位,应用地高辛标记的凝胶阻滞实验检测Smad-DNA结合活性;通过Western blot法检测RhoA蛋白表达水平,RT-PCR法检测ROCK2 mRNA水平。 3、应用慢病毒载体介导的RNA干扰技术,构建含针对ACE2基因的RNA干扰序列的慢病毒敲除载体,并感染HSC细胞株,real time PCR法和Western blot法检测干扰效率;通过Western blot、RT-PCR、基因定量(QuantiGene)等方法,检测AngⅡ和Ang-(1-7)干预及ACE2基因沉默前后HSC中COL1和CTGF表达的变化,同时利用信号通路抑制剂阻断方法,比较分析ACE2-Ang-(1-7)对HSC胶原合成的影响。 结果 1肝纤维化大鼠肝内ACE2和Mas表达增高 在给予大鼠皮下注射CCl44周后,HE染色见肝小叶结构破坏,肝纤维结节形成;免疫组化表明,肝脏ACE2表达水平明显增加,而且广泛分布;RT-PCR结果显示,与对照组相比,CCl4注射2周后大鼠肝内ACE2 mRNA水平轻度增加,但CCl4累积到4周时,ACE2水平显著增加(0.509±0.105 vs 0.114±0.044,P=0.000)。Western blot结果显示,ACE2蛋白表达水平变化与ACE2 mRNA表达水平相一致。Mas基因表达水平与ACE2的表达变化基本平行。此外,应用perindopril(一种ACE抑制剂(ACE inhibitor, ACEI))可促使肝损伤大鼠ACE2水平上调,提前出现ACE2增高,且增高水平较单独CCl4处理组显著(P=0.000)。 2 AngⅡ处理后HSC中ACE2和Mas表达增高 AngⅡ干预处理HSC 24hr后,ACE2及Mas mRNA的表达水平增加,且与不同浓度干预的AngⅡ呈剂量依赖性效应关系。当AngⅡ升至1μmol/L (μM)时两者表达与对照组比较均有显著性意义差别(分别为对照的1.553±0.090和1.536±0.053倍,均P0.01)。Western blot分析进一步证实不同浓度AngⅡ处理后,HSC中ACE2蛋白水平呈剂量依赖性地增高。此外ACEI预处理组可使ACE2表达及Mas mRNA水平较AngⅡ处理组进一步增加(均P0.01)。 3 Ang-(1-7)抑制AngⅡ激活HSC中Smad信号通路 在AngⅡ干预HSC 5min后,即可检测到磷酸化Smad3 (pSmad3)增加,与对照组相比差异有统计学意义(为对照的2.183±0.222倍,P=0.003),15 min时pSmad3蛋白水平达到高峰,之后pSmad3逐渐降低。AngⅡ干预0-120min内各时间点非磷酸化Smad3蛋白表达水平无明显变化。AngⅡ处理HSC 20 min后,免疫荧光检测可见Smad4蛋白明显的核转位;凝胶阻滞实验(EMSA)显示Smad DNA-结合活性较对照组显著增加(为对照的9.007±1.007倍,P=0.000)。单独Ang-(1-7)干预HSC与对照组相比无显著变化(均P0.05)。Irbesartan (AT1R阻断剂)或Ang-(1-7)预处理HSC可抑制AngⅡ诱导的Smad3磷酸化(均P0.01)、Smad4核转位以及Smad DNA-结合活性增加(均P0.05),Mas受体阻断剂A779则明显逆转Ang-(1-7)对AngⅡ诱导Smad3磷酸化和Smad DNA结合活性增加(均P0.01),提示AngⅡ通过AT1R途径迅速激活Smad通路,Ang-(1-7)则通过Mas受体发挥拮抗AngⅡ作用。SB203580 (p38 MAPK的抑制剂)预处理亦可显著抑制AngⅡ诱导Smad3磷酸化(P=0.000),而PD98059 (p42/44 MAPK或称ERK 1/2的抑制剂)预处理组则否(P=0.575)。提示AngⅡ快速激活Smad通路依赖于p38 MAPK的活化。 4 Ang-(1-7)抑制AngⅡ激活HSC中Rho/ROCK通路 AngⅡ干预处理HSC 24hr后,RhoA蛋白表达及ROCK2 mRNA水平较正常对照显著增高(均P=0.000), Irbesartan、Ang-(1-7)以及Y27632 (ROCK抑制剂)预处理组RhoA蛋白与ROCK2 mRNA表达均显著低于AngⅡ处理组(均P0.01)。A779可以逆转Ang-(1-7)抑制AngⅡ诱导RhoA与ROCK2表达的作用(均P0.01)。实验提示AngⅡ通过AT1R途径激活Rho/ROCK通路,Ang-(1-7)则通过Mas受体拮抗此作用。 5 ACE2-Ang-(1-7)抑制AngⅡ诱导HSC胶原合成 设计shRNA并构建慢病毒载体,验证HSC感染细胞株中针对ACE2基因的干扰效率,Western blot检测基因敲除后ACE2蛋白水平约为正常对照的2/3(0.154±0.018 vs 0.446±0.026,P=0.000),命名为Lenti-SiACE2。 分别利用RT-PCR检测Ⅰ型胶原(COL1) mRNA、Western blot检测结缔组织生长因子(CTGF)蛋白以及QuantiGene Plex方法分析COL1和CTGF mRNA的表达水平,结果提示AngⅡ作用24hr后,可诱导HSC中COL1和CTGF表达增加,与正常对照比较差异有统计学意义(均P0.01)。Lenti-SiACE2感染细胞后COL1和CTGF表达与正常HSC对照无差别(P=1.000),但加入AngⅡ刺激后,它们的表达显著增强,较AngⅡ干预正常HSC细胞株更加明显(均P0.01),提示ACE2基因干扰后AngⅡ促HSC胶原合成作用放大。Ang-(1-7)预处理可抑制AngⅡ诱导的HSC COL1和CTGF高表达(均P=0.000),此作用可被其Mas受体的阻断剂A779逆转(均P=0.000). QuantiGene Plex检测数据还提示,Ang-(1-7)对AngⅡ诱导COL1和CTGF mRNA表达的抑制程度较SB203580、PD98059以及Y27632对AngⅡ的这种抑制更加明显(与Y27632组CTGF表达比较P0.05,其余均P0.01)。提示HSC胶原合成有多种信号通路参与调节,Ang-(1-7)可通过全面阻断AngⅡ的活性而抑制HSC胶原合成。 结论 1、随着肝纤维化进展大鼠肝内ACE2和Mas受体表达增强,可能是机体对肝损伤应激的一种自我保护机制。在体外HSC中ACE2和Mas受体表达随AngⅡ浓度增加而增高,推测这是HSC中RAS维持系统平衡的反馈调节机制,即对过多AngⅡ的拮抗反应。此结果支持ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴对肝纤维化起保护作用的假设。ACEI上调ACE2的表达,可能有延缓肝纤维化进展的作用。 2、AngⅡ可通过其受体ATlR激活HSC中Smad和Rho/ROCK信号通路,这可能是AngⅡ促肝纤维化的重要机制。Ang-(1-7)可通过拮抗AngⅡ的活性而抑制AngⅡ对这两个通路的激活。另外,p38 MAPK的抑制剂可以减少AngⅡ诱导的Smad3磷酸化,提示AngⅡ可以经非TGF-β依赖途径直接激活Smad信号通路。 3、AngⅡ刺激可显著增加HSC中COL1和CTGF的表达,ACE2基因沉默后加重AngⅡ对这两者的诱导表达作用,而Ang-(1-7)则可抑制AngⅡ对它们的诱导表达,且其抑制程度较p38 MAPK, ERK 1/2和Rho/ROCK的阻断剂对AngⅡ诱导COL1和CTGF表达的抑制作用更加明显。结果提示ACE2-Ang-(1-7)可通过拮抗AngⅡ的作用而明显抑制HSC中胶原的合成,起着重要的抗纤维化作用,这对于扩展肝纤维化治疗新策略具有重要意义。


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