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骨髓源性肝干细胞体外扩增后自体移植的临床应用研究

袁杰  
【摘要】: 目前对于晚期肝病(如肝硬化等)的最佳治疗方法是肝脏移植,但是由于缺少供体以及排斥反应,使其在临床上的应用受到限制。相比之下,干细胞移植不仅来源广泛,创伤性小,而且干细胞的免疫源性低,其排斥反应远远低于肝脏移植。干细胞移植不但可以用于晚期肝病,也可以用于重症肝病的治疗,前景广阔。骨髓细胞可以分化形成肝细胞的特定干细胞群,被称之为骨髓源性肝干细胞(bone marrow derived liver stem cells BMDLSC),为肝脏疾病治疗提供了新思路和新手段。尽管肝干细胞的特征性表面标记至今没有发现,但Lagasse在酪氨酸小鼠研究中发现c-kit+Sca+Lin-细胞向肝细胞分化的能力比较强,而后唐等在放射性小鼠肝损伤修复更是进一步指出c-kit+Lin-(CD117)是一群富含BMDLSC的骨髓干细胞群,本小组前期研究已经证实,骨髓中CD117阳性细胞和CD184阳性细胞都具有较强的肝干细胞潜能。与其它类型的骨髓干细胞类似,c-kit+Lin细胞的数量有限,难以满足未来应用的需要。 本实验利用非连续Percoll密度梯度离心对人自体骨髓进行分离,分离后的各界面层的细胞进行流式检测CD117阳性细胞和CD184阳性细胞的比例,确定比例最高的细胞群后,从新鲜骨髓中获取富含CD117阳性细胞和CD184阳性细胞的组分用于后实验。然后将细胞在体外培养扩增0天、7天、14天,扩增方案采用含10%自体血清的高糖DMEM培养基体系中和无血清的高糖DMEM培养基体系中加入不同浓度的促肝细胞生长素(HGPF)、促血小板生长素(TPO)和白细胞介素3(IL-3),分别培养摸索最佳培养基体系,经最佳培养基体系培养后用流式细胞计数法测定扩增细胞中CD117阳性细胞和CD184阳性细胞的数量变化,用实时定量PCR法检测(c-Met RNA表达的变化。总结出人自体骨髓来源肝干细胞体外扩增后自体移植的技术方案,为将来临床上进行骨髓来源肝干细胞体外扩增后自体移植治疗肝脏疾病奠定基础。 [材料和方法] 1、密度梯度离心结合流式细胞术提取骨髓来源肝干细胞 1.1 Percoll不连续密度梯度沉淀法分离骨髓细胞群 从骨科手术回收成人骨髓2-5ml,使用percoll作为分离液,分成60%(1.077g/ml)、50%(1.067 g/ml)、40%(1.056 g/ml)、30%(1.043 g/ml)四个密度费联系梯度,分离出4个有核细胞组分。 1.2流式细胞仪检测各个细胞组分中CD117阳性细胞核CD184阳性细胞比例 细胞计数后,取1×106个细胞置于1.5ml EP管中,离心调整为100μl体积,避光环境下,各管分别以PE标记抗人CD117直接抗体和APC标记抗人CD184直接抗体,细胞重悬至300μl上机检测,分别记录CD117阳性细胞核CD184阳性细胞比例。 2、人骨髓源性肝干细胞体外扩增方案的探讨 2.1密度梯度离心结合流式细胞术分离富含CD117+细胞群 采集人体骨髓10-20ml,使用percoll作为分离液,分成50%(1.067 g/ml)、40%(1.056 g/ml)两种浓度,过滤除菌后,由下至上按密度递减置于离心管中,将预处理后的骨髓细胞悬液缓慢加至分层液上,400g离心力,离心25~30分钟,可见各密度层间细胞层,留取CD117+细胞比例最高(Percoll浓度为50%与40%之间的细胞层)的细胞层为目的细胞群。 2.2体外扩增富含CD117+人自体骨髓来源肝干细胞 2.2.1确定细胞培养密度 骨髓细胞悬液,经密度梯度离心后,留取Percoll浓度为50%与40%之间层的细胞群,分别调整细胞浓度至6.25×105/ml、1.25×106/ml、2.50×106/ml、5.00×106/ml、1.00×107/ml、2.00×107/ml五组细胞浓度,于24孔板上培养14天,,培养基为DMEM培养基(高糖,含10%自体血清,2mg/ml注射用盐酸头孢甲肟),分别细胞计数分析。 2.2.2确定细胞扩增最佳体系 培养基为DMEM培养基(高糖,2mg/ml注射用盐酸头孢甲肟),分别添加注射用促肝细胞生长素(10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、800μg/ml),注射用促血小板生长素(25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml),白细胞介素3(5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml),自体血清(10%、0%),共计128种组合。骨髓细胞悬液经密度梯度离心后,留取Percoll浓度为50%与40%之间层的细胞群,于24孔板上,随机分成138份按确定的最佳细胞密度(细胞浓度为2.50×106/ml)分别加入到上述各培养基组合中,共计128孔,另外10份加入到随机培养基组合中,作为计数对照孔,培养14天,根据生长情况传代。分别记录7天和14天细胞数量。 2.3最佳体系扩增后检测 配置最佳培养体系:DMEM培养基(含10%自体血清,40μg/mL注射用促肝细胞生长素,50ng/ml注射用TPO,10ng/ml白细胞介素3,2mg/ml注射用盐酸头孢甲肟)。 2.3.1最佳扩增体系培养前后细胞表面CD117、CD184标记的变化采集8例肝硬化患者骨髓,经密度梯度离心后,留取Percoll浓度为50%与40%之间层的细胞群,于37℃、5% CO2孵育,每3-4天更换1/3量培养基,根据生长情况传代,分别于培养前,培养第7天、第14天留取样本,在100ul环境中按1×106细胞加入20ul PE标记抗人CD117直接抗体以及20ul APC标记抗人CD184直接抗体孵育20分钟,600g离心3分钟,去上清,用1×PBS吹打匀细胞,600g离心力离心3分钟,清洗3次,分别进行流式细胞仪检测,观察和计算最佳培养基体系培养7天、14天后,细胞组分中CD117阳性细胞、CD184阳性细胞扩增倍数。 3、人骨髓源性肝干细胞体外扩增后c-Met RNA表达的变化 3.1分组 扩增0天(阴性对照)、扩增7天、扩增14天以及肝组织细胞(阳性对照) 3.2引物设计合成 GenBank上查找目的基因mRNA序列,在CDS区设计特异性引物。设计引物所用软件名称:Primer express 2.0软件,序列如下: Sequence Name:H-HGFR(扩增片段长度101bp) Forward Primer:5'-GCT GGA ACA CCC AGA TTG TTT C-3' Reverse Primer:5'-CGA CAA CTA GAG CCA TGT TGA TG-3' Sequence Name:H-β-actin(扩增片段长度106bp) Forward Primer:5'-GCA TGG GTC AGA AGG ATT CCT-3' Reverse Primer:5'-TCG TCC CAG TTG GTG ACG AT-3' 细胞总RNA的提取,逆转录反应(反应条件:37℃1h,然后95℃3分钟),荧光定量PCR反应(反应条件为:93℃3分钟,然后93℃30秒,55℃45秒,72℃45秒,共40循环)。 3.3计算各细胞群HGFR/c-Met mRNA的表达水平与内参基因H-β-actin比值 反应结束后,由电脑自动分析并计算结果。结果拷贝数,用B表示,即B=拷贝数/μl cDNA。考虑到各个样本总RNA浓度的差异,最终计算结果按下列公式换算:A=Bl(目的基因)÷B2(内参基因),A则为HGFR/c-Met mRNA的表达水平与内参基因H-β-actin比值。 4.统计分析 所有数据用X±S表示。应用SPSS 13.0统计分析软件进行统计学处理。分析各层细胞比例的差别时,检验方法采用完全随机设计多样本比较的秩和检验(Kruskal-Wallis H检验);确定细胞扩增最佳体系时,采用多因素方差分析F检验,检验4个主因素对细胞数的影响,两两比较用Benforroni法;最佳培养基体系培养的情况时,经方差齐性检验,方差齐的,第0天组与第7天组扩增倍数比较,采用单样本t检验与第0天比较,第0天扩增倍数为1,第7天组与第14天组扩增倍数比较,方差齐时采用两独立样本t检验,方差不齐时采用两独立样本的Wilcoxon秩和检验;分析各组细胞c-Met mRNA表达水平的差别时检验方法采用完全随机设计多样本比较的秩和检验(Kruskal-Wallis H检验)。以P0.05表示差别有统计学意义。 [结果] 1.密度梯度离心后分离出4个细胞组分,介于Percoll 40~50%梯度之间的细胞组分中CD117阳性细胞和CD184阳性细胞比例最高,分别为2.11±0.49%、5.71±1.04%。 2.含10%自体血清的高糖DMEM培养基体系中加入HGPF40μg/ml、TPO 50 ng/ml、IL-3 10 ng/ml组的扩增效果最好,扩增7天的CD117阳性细胞数量和CD184阳性细胞数量分别增加6.55倍和6.20倍,第7天组与第0天组比较扩增倍数有显著性差异(t=11.257,P=0.000;t=16.664,P=0.000),扩增14天的CD117阳性细胞数量和CD184阳性细胞数量分别增加11.62倍和20.57倍,第14天组与第7天组比较扩增倍数有显著性差异(t=6.936,P=0.000;t=18.322,P=0.000)。 3.与内参基因H-β-actin之比,经上述最佳培养基体系培养扩增0天、7天、14天和正常肝组织c-Met RNA表达水平c-Met/H-β-actin分别为0.016±0.005、1.873±1.954、0.340±0.113和0.140±0.086(x2=21.651,P=0.000),第7天HGFR/c-Met mRNA表达水平最高,呈现第7天升高,随后第14天时下降,肝细胞次之。 [结论] 1)人骨髓有核细胞经Percoll密度梯度离心后,位于40%与50% Percoll层之间的细胞群CD117阳性和CD184阳性的细胞比例最高。 2)含10%自体血清的高糖DMEM培养基体系中加入HGPF40μg/ml、TPO 50 ng/ml、IL-310 ng/ml是体外扩增骨髓源性肝干细胞的可行方案;按以上培养方案,7天时CD117阳性细胞和CD184阳性细胞的扩增倍数分别达到6.55倍和6.20倍,14天时CD184阳性细胞和CD117阳性细胞扩增倍数分别为11.62倍和20.57倍。临床应用本方案扩增骨髓源性肝干细胞可以显著减少抽取骨髓的需要量。 3) BMDLSC细胞经上述扩增方案扩增0天、7天、14天后,细胞的c-Met RNA表达水平表现为先上升后下降,分别为0.016±0.005、1.873±1.954、0.340±0.113,提示细胞在扩增过程中可能存在分化,体外扩增的时间不宜过长。


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