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白纹伊蚊miRNA的测序、鉴定及表达谱的初步分析

郑培明  
【摘要】: MicroRNA (miRNA)是一类大小约21—23个碱基的单链小分子非编码RNA,能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译,从而对基因进行转录后表达的调控。大多数miRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ转录而来,形成一个长度约几百至上千个碱基的初级转录本primary miRNA(pri-miRNA), primary miRNA既可以是单顺反子结构形成一个成熟的miRNA,也可以是多顺反子结构产生多个成熟miRNAs。在果蝇中primary miRNA在核内被核糖核酸酶Drosha-Pasha复合物加工处理而最终成为具有茎环结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体pre-miRNA(precursor miRNA),之后pre-miRNA被核输出蛋白exportin-5转运入胞质,接着被第二个核糖核酸酶Dicer-1消化为miRNA:miRNA*双链复合物,随后由解螺旋酶将其分解成两条单链,多数情况下miRNA*链快速降解而另一条链则成为成熟的miRNA,这个阶段的miRNA可以结合RISC (RNA-Induced Silencing Complex)并与靶标mRNA的3’非翻译区互补配对,miRNA和靶序列的互补程度决定了靶基因mRNA或者在翻译水平被抑制,或者被降解。植物体中降解是主要的工作方式,而哺乳动物中则以翻译水平的抑制为主要方式。 miRNA广泛存在于动物、植物、细菌、病毒等多种生物物种中。研究表明大多数miRNA在生物进化过程中高度保守,并且其表达具有时序性和组织特异性[2],现已证实miRNA参与和调控了包括细胞凋亡、癌症发生、组织分化、发育、神经元发育、炎症、病毒感染等多个生理病理过程。 昆虫miRNA的研究最早主要是以果蝇为模型展开,据推测,在果蝇的不同发育阶段约有110种不同的miRNAs表达,通过软件预测与同源比对分析的方法在冈比亚按蚊中发现66种miRNAs。在斯氏按蚊miRNA研究方面,通过小规模的测序以及Northern blot的方法首次实验验证了蚊虫中miRNA的存在。随着近年来新一代高通量测序技术在small RNA研究领域的应用,研究者已经对埃及伊蚊以及致卷库蚊的miRNA进行了深度测序分析。到目前为止,在蚊虫中共发现miRNA上百种,其中部分miRNA目前只在蚊虫中发现,尚未在其他物种中发现。通过对miRNA在蚊虫从虫卵到成蚊不同发育阶段的表达谱分析,以及在雌蚊吸血前后的表达变化,发现miRNA可能在蚊虫的胚胎发育、组织分化、病原体感染过程中起到重要的调控作用。对蚊虫中miRNA功能以及作用机制的进一步了解,将有助于我们对蚊虫的生长发育、繁殖、经蚊虫传播的病原体感染等方面的研究。 白纹伊蚊是登革病毒的重要传播媒介,广泛分布于我国南方大部以及东南亚地区[20]。2010年Rebecca L等对白纹伊蚊C7/10细胞miRNA进行了深度测序,共鉴定出65种miRNAs。但有关白纹伊蚊成蚊miRNA的研究尚未见报道,本实验研究利用新一代高通量测序技术solexa测序对白纹伊蚊不同发育阶段混合样本的小RNA进行了深度测序,并通过后续的生物信息学分析鉴定并预测了上百种miRNAs,并且通过Northern blot的方法对部分miRNAs做了白纹伊蚊不同发育阶段的表达谱分析以及在雌蚊吸血前后的表达变化。通过分析显示miRNAs与白纹伊蚊的胚胎发育、变态发育以及吸血进程有关,对其靶标的预测以及作用机制的进一步研究,将有助于我们对白纹伊蚊各种生物学特性的了解,为将来的蚊虫防控工作打下基础。 研究目的: 1.通过新一代高通量测序技术solexa测序,对白纹伊蚊整个物种进行小RNA深度测序,并通过后续的生物信息学分析,对测得的每一条小RNA序列进行注释,鉴定已知miRNA与目前尚未发现的新型miRNA。 2.根据测序结果及相关文献选取部分miRNA,通过Northern blot的方法实验验证白纹伊蚊中miRNA的存在并对其不同发育阶段做表达谱分析。对部分miRNA研究其在雌蚊吸血前后的表达变化。 研究方法: 1白纹伊蚊small RNA的solexa测序 1.1白纹伊蚊样本的收集 分别收集12-24h虫卵、早期幼虫、晚期幼虫、虫蛹、羽化3-5天雄蚊、雌蚊等六个不同阶段样本。 1.2 Total RNA的提取与鉴定 将不同阶段样本收集后放液氮冷冻十分钟,然后用Trizol提取各个不同阶段样本的Total RNA,核酸测量仪检测浓度及纯度,15%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所提Total RNA的质量。 1.3测序 样品首先通过生物分析仪Agilent Bioanalyzer进行检测,样品合格后,首先将18-30 nt范围的small RNA从Total RNA中分离出来,两端分别加上特定接头后体外反转录做成cDNA再做RT-PCR扩增,然后利用测序仪对DNA片段进行单向末端直接测序。 1.4基本生物信息学分析 对测序结果进行去接头、去低质量、去污染等处理,得到去杂质的“干净”序列,用于后续的高级分析。 1.5高级生物信息学分析 通过与rRNAetc (rRNA,tRNA,snRNA,snoRNA等non-coding RNAs)、已知的miRNA、repeat、exon/intron等降解片段的比对,将每条小RNA序列进行注释。选择没有比对上任何注释信息的小RNA和与intron关联的小RNA去预测新的miRNA. 2.白纹伊蚊miRNA的表达谱分析以及雌蚊吸血前后的表达差异分析 2.1白纹伊蚊各个不同阶段样本的收集 分别收集12-24h虫卵、早期幼虫、晚期幼虫、虫蛹、羽化3-5天雄蚊、未吸血雌蚊等六个不同发育阶段样本。 2.2 Total RNA的提取与鉴定 将不同阶段样本收集后放液氮冷冻10min,然后按照mirVanaTM miRNA Isolation Kit中Total RNA提取的相关步骤进行实验,核酸测量仪检测浓度及纯度,15%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所提Total RNA的质量。 2.3白纹伊蚊不同发育阶段的miRNA表达谱分析 分别取等质量的六个不同发育阶段样本的Total RNA,依次进行电泳、半干转印、交联、杂交、洗膜、曝光检测。 2.4雌蚊吸血前后miRNA的表达差异分析 分别取等质量的吸血与未吸血雌蚊样本的Total RNA,依次进行电泳、半干转印、交联、杂交、洗膜、曝光检测。 研究结果: 1.通过对白纹伊蚊小RNA的深度测序以及生物信息学分析,共测得序列12663936条,1801570种。其中通过与miRBase14.0数据库比对分析得到92种已知miRNAs,通过miRNA预测软件mireap预测新的miRNAs46种。 2. miRNA在白纹伊蚊不同发育阶段的表达谱分析共选择12种miRNAs进行验证,包括6种保守性miRNAs与6种蚊虫特异性miRNAs。所有的miRNAs在白纹伊蚊中均得到验证,并且大多数miRNA在蚊虫的不同发育阶段具有表达差异。 3. miRNA在白纹伊蚊雌蚊吸血前后的表达差异共选择4种miRNAs (miR-184、miR-998、miR-989、miR-N1)做吸血前后的表达差异分析,其中3种miRNAs在雌蚊吸血后表达水平增加,miR-N1在雌蚊吸血后才开始有表达。 研究结论: 1.通过solexa高通量测序技术,首次对白纹伊蚊这一物种的小RNA进行了深度测序,通过测序以及生物信息学分析共鉴定出已知miRNA92种,预测新的miRNA46种。 2.通过Northern blot的方法,实验验证了白纹伊蚊中miRNA的存在,并且通过对白纹伊蚊不同发育阶段的表达谱分析,发现大多数miRNA表达具有期特异性,提示miRNA可能在蚊虫的生长发育过程中起到重要的调控作用。 3.4种miRNAs在雌蚊吸血后表达量增加,提示其有可能在蚊虫的繁殖、胚胎发育过程中起到重要调控作用。


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