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缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在病理性瘢痕形成中的作用

郑旭东  
【摘要】: 一、研究背景: 增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是临床上常见的病理性瘢痕,尤其是瘢痕疙瘩,其过度增殖能力以及难以控制的术后再复发长期困绕整形外科学界。尽管国内外众多学者尽管经过长期、大量的研究,对瘢痕的认识也已深入分子领域,但病理性瘢痕的形成机制目前仍不清楚,异常瘢痕发生的机制研究仍是整形外科学的重点和难点之一 本课题组在前期的研究中,应用人类8,064个点的基因表达谱芯片研究比较了病理性瘢痕与正常皮肤组织的基因差异表达情况,较为全面的了解了与病理性瘢痕形成相关的基因。结果发现,与正常皮肤组织相比,增生性瘢痕组织中发生显著性差异表达变化的基因有171个,其中上调99个,下调72个。瘢痕疙瘩组织中发生显著性差异表达变化的基因有277个,其中上调163个,下调114个,说明病理性瘢痕的形成涉及多个基因的差异表达变化,证实了病理性瘢痕的发生、发展是一多基因、多阶段的过程,包括免疫、细胞凋亡、原癌基因和抑癌基因、细胞骨架运动等多种因素参与了异常瘢痕的发生。如何分析这些大量的数据,提取有用的信息,指导进一步的深入研究至关重要。 为此,本课题组采用文献轮廓的数据挖掘技术(GenCLiP)对表达谱芯片结果进行生物信息学分析。GenCLiP的原理是根据微阵列表达谱数据,采用基于文献轮廓的数据挖掘方法,从Medline文献数据库中提取基因的相关文献并分析词的频率,再基于重复发生和共发生的过滤标准提取功能相关的词,最后基于词的发生频率对基因进行功能聚类。主要目的在于用来指导复杂的表达数据库的解释。从病理性瘢痕的差异表达基因谱中得到197个已知基因名称的差异表达基因,应用PUBMED检索得到87,282篇摘要,经过文字识别与数据过滤后,得到23个相关词。经聚类分析,筛选出与缺氧和增殖密切相关的缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α),可能是在病理性瘢痕形成中起重要作用的一个新基因。 早在20世纪70年代Kischer等就认为低氧在病理性瘢痕的形成过程中起着重要作用。低氧能影响成纤维细胞的活性,胶原的合成与降解及生长因子的分泌这三大病理性瘢痕形成的主要因素。文献表明,在病理性瘢痕早期,由于组织内高细胞密度、高细胞活性均可以导致瘢痕内缺氧。瘢痕疙瘩中血管明显少于增生性瘢痕,且扫描电镜和透射电镜观察表明,在瘢痕疙瘩组织中的微血管因内皮细胞的增殖而存在阻塞现象,而导致组织低氧状态。因此,目前认为血管少、缺氧是异常疙瘩形成的病理生理基础。 机体可以感受O2浓度变化并对缺氧做出适应性反应,基因表达调控是这种适应性反应的一种主要方式。缺氧可以启动许多基因的转录,用以维持组织氧供并增强细胞在严重缺氧情况下的生存能力。随着对缺氧反应的基因表达调控研究的不断深入,不仅发现HIF-1是这些基因表达的主要调节者,在缺氧的生理反应中起着中枢纽带作用,而且在正常胚胎发育过程中以及维持肿瘤细胞的代谢适应、新血管形成及转移等方面都起了极为重要的作用。 HIF-1基因定位于人14q21-24,是一种由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成的异源二聚体(或四聚体)。HIF-1的生物活性是由HIF-1α亚基决定的,HIF-1α蛋白是直接感受缺氧的感受器,HIF-1α的表达严格地受O2浓度调节。在常氧条件下,HIF-1α由其结构中的氧依赖降解结构域(ODD)控制,并通过泛素-蛋白酶体途径迅速降解,几乎检测不到HIF-1α蛋白。而在低氧条件下,HIF-1α的泛素化和降解过程受抑制,导致HIF-1α蛋白在胞内积聚,并与HIF-1β聚合,形成有活性的HIF-1蛋白,调控着众多基因如血管内皮生长因子(vescular endothelial growth factor, VEGF)、胰岛素样生长因子-2(insulin-like growth factor-2, IGF-2)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、间质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)、促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)等60多个基因的转录和表达,引起细胞对缺氧的一系列适应性反应。其中部分基因已被证明同病理性瘢痕的形成有重要关系。国外有学者也发现瘢痕疙瘩中存在HIF-1α上调表达的现象,国内李高峰等发现HIF-1α在烧伤后瘢痕内缺氧的减轻过程中可能发挥重要作用,但尚未有人对瘢痕疙瘩中HIF-1诱导的缺氧通路进行探索。因此,明确HIF-1在与瘢痕疙瘩形成中的作用及其缺氧通路调控机制,对于阐明瘢痕疙瘩的形成机制,提高临床瘢痕疙瘩防治水平具有重要的理论和实践意义。 二、研究目的: 1、比较正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩组织中HIF-1α的表达,以及低氧培养下正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纤维细胞中HIF-1α的表达,分析HIF-1α在病理性瘢痕形成中的作用。 2、比较瘢痕疙瘩在常氧和不同程度缺氧条件下HIF-1α的表达,以及细胞活性、细胞周期分布和胶原分泌方面的差异,分析缺氧及其引发由HIF-1α调控的缺氧通路在瘢痕疙瘩异常增生中的作用机制。 三、材料和方法: 1、研究对象 瘢痕疙瘩和增生性瘢痕各4例。瘢痕疙瘩全部取自耳垂部发病患者,且之前均为接受过相关治疗。四例增生性瘢痕取自患者四肢部位,为求改善外观和功能而作切除。正常组织4例,来源于无瘢痕体质趋势及无免疫性疾病的包皮环切术标本,患者年龄12~40岁。取材前均向患者说明取材目的,并征得患者同意。 2、研究方法 ①逆转录多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)法检测HIF-1α基因表达; ②蛋白质印记法(Western Blotting)检测HIF-1α基因表达; ③甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色法检测细胞活性; ④流式细胞仪检测细胞周期; ⑤羟脯氨酸比色法检测胶原合成水平。 四、结果: 1、病理性瘢痕组织中HIF-1α基因表达 RT-PCR和Western Blotting结果显示:病理性瘢痕组织中HIF-1α的mRNA及蛋白质表达水平均明显高于正常皮肤组织(P0.01)。 2、低氧培养条件下病理性瘢痕成纤维细胞HIF-1α基因表达 RT-PCR和Western Blotting结果显示:低氧浓度培养的病理性瘢痕成纤维细胞中HIF-1α的mRNA及蛋白质表达水平均明显高于正常皮肤成纤维细胞(P0.01)。 3、不同程度低氧培养条件下瘢痕疙瘩成纤维细胞HIF-1α的表达 瘢痕疙瘩成纤维细胞在常氧(20%)、不同缺氧浓度(10%、5%、1%)下,HIF-1α蛋白表达相对含量(HIF-1α/β-actin)分别为0.007±0.006、0.133±0.006、0.537±0.015和0.903±0.021,表明缺氧系统中瘢痕疙瘩成纤维细胞HIF-1α蛋白表达明显上调。 4、不同程度低氧培养条件下瘢痕疙瘩成纤维细胞活性、细胞周期和Ⅰ型胶原合成的检测 不同程度缺氧各组中的瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖均明显高于常氧对照组,且S期比例也增高;随着O2浓度的降低,成纤维细胞胶原合成水平逐渐增加。 五、结论: 1、HIF-1α在病理性瘢痕中的上调表达提示HIF-1α及其调控的缺氧通路可能与病理性瘢痕类似于良性肿瘤的分裂增殖特性相关。 2、缺氧条件促进了瘢痕疙瘩中HIF-1α蛋白的表达,而且表达的量与缺氧程度呈正相关关系。 3、缺氧条件能增强瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖活力,提高胶原合成水平。这一结果很可能是通过HIF-1α及其调控的缺氧通路产生作用。提示阻断瘢痕疙瘩内HIF-1α调控的缺氧通路有望成为预防及治疗瘢痕增生的新途径。


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