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趋化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25在肝纤维化和肝硬化病人肝组织中的表达变化

黄勇平  
【摘要】: 骨髓源性肝干细胞(Bone marrow derived liver stem cells, BMDLSC)是指骨髓干细胞中可以分化形成肝细胞的特定干细胞群。这类干细胞的发现,为肝脏疾病治疗提供了新思路和新手段。小鼠BMDLSC移植实验证实,BMDLSC对CCL4及酒精所致小鼠肝纤维化具有逆转作用。但是在生理状态下定居在骨髓内的BMDLSC,为什么在移植后会向肝脏迁移并发挥修复作用,调控移植后BMDLSC向肝脏迁移的因素又有哪些,它们又是如何调控BMDLSC向肝脏迁移的,这些问题目前都未明了。 近些年来,学者们发现趋化因子有可能是驱使BMDLSC向肝脏迁移的一个重要因素,其中基质细胞衍生因子-la (SDF-1a)已在动物实验中证实可以驱使CXCR4阳性的骨髓源性肝干细胞向肝内聚集并诱导其向肝细胞和胆管细胞分化,我们此前的临床研究也观察到SDF-1a在肝脏发生纤维性增生时表达增多,并且表达数量与肝纤维化程度相关,提示SDF-1a在人体内同样有可能是趋势BMDLSC向肝脏迁移的一个重要因素。在体外试验中,单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1,系统命名为CCL2)、调节活化正常T细胞表达和分泌因子(Rantes,系统命名为CCL5)、人单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3,系统命名为CCL7)、人二级淋巴组织趋化因子(SLC,系统命名为CCL21)和人胸腺表达趋化因子(TECK,系统命名为CCL25)等趋化因子可以驱使骨髓间充质干细胞向其浓度递增方向迁移,且趋化能力大小与上述趋化因子的浓度成正相关。提示这些趋化因子在体内也有可能是调控BMDLSC向肝脏迁移的的因素。但是,趋化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25在肝脏的表达情况至今仍未见报道。 本实验采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)对正常肝组织和肝纤维化与肝硬化肝组织中趋化因子CCL2、CCL5. CCL7、CCL21和CCL25的表达水平进行了检测。方法参照人ELISA试剂盒内所附的操作说明。结果显示,肝脏发生肝纤维性增生损伤时,肝组织中趋化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25的含量显著增加,随着病变由肝纤维化向肝硬化发展,肝组织中CCL2、CCL5、CCL21和CCL25水平也进一步升高,但CCL7水平呈下降趋势。 [材料和方法] 1.肝组织取自30例病人,均来自2008年5月-2009年5月在南方医科大学南方医院肝胆外科接受手术(包括肝移植)的病人。其中男性17例,女性13例。年龄19-77岁,平均50岁。30例标本共分为3组: ①正常对照组(n=9):乙肝表面抗原阴性,丙肝抗体阴性,肝脏生化功能正常(转氨酶、胆红素、血清白蛋白、凝血酶原时间),Child-Pugh肝功能分级评估为A级,肝组织病理学检查显示肝组织结构正常。 ②肝纤维化组(n=10):乙肝表面抗原阳性,有或无乙型肝炎病史,丙肝抗体阴性,肝脏生化功能正常或异常,Child-Pugh肝功能分级评估为A级,组织病理学检查显示肝内纤维化组织增生,但无假小叶形成。 ③肝硬化组(n=11):乙肝表面抗原阳性,有或无乙型肝炎病史,丙肝抗体阴性,肝脏生化功能检查轻度至重度异常,Child-Pugh肝功能分级评估为A-C级,病理学检查显示肝内广泛纤维组织增生,肝小叶结构被破坏,假小叶及再生结节形成。 2.观察指标与方法 2.1临床症状与体征体查确认患者有无黄疸,有无肝掌与痴蛛痣,有无腹腔积液,有无肝性脑病,以及这些症状体征的程度。 2.2影像学检查肝脏CT扫描和肝脏B型超声检查。 2.3实验室检查乙肝两对半、丙肝抗体试验,手术当天抽血查肝脏生化功能指标:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)、血清总胆红素(TBIL)、凝血酶原时间(PT)。 2.4组织病理学检查肝组织经固定、石蜡包埋、脱蜡至水及HE染色后,光学显微镜下观察。 2.5肝组织中趋化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25含量的测定 2.5.1肝组织的匀浆、离心精确称重肝组织后移入微量手动玻璃匀浆器中于低温环境中彻底匀浆,按比加入1×PBS缓冲液将匀浆组织洗下并转移至1.5ml EP管中,在低温高速离心机中以4℃、1000×g离心力离心10min,提取上清液移至另一1.5ml EP管中,再次于4℃下25000×rpm离心20min,取上清液待测。 2.5.2 ELISA法测定以上五种趋化因子的含量采用双抗体夹心ELISA法,即将上述五种趋化因子与包被于酶标板上的单抗结合后,再结合生物素化相应的趋化因子抗体,加入底物A和B进行显色,在酶标仪上读取450nm的波长OD值,趋化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25的浓度与分别与对应的OD值成比,用SPSS统计软件进行曲线拟合,得到拟合效果最佳的标准曲线后,再计算出标准曲线方程,最后求出标本离心液中的趋化因子的浓度。 3.统计学分析 最终计量数据均以均数±标准差(x±S)表示,应用SPSS13.0统计分析软件进行数据处理。行×列表资料采用χ2检验;多组均数比较,如方差齐性采用单因素方差分析(one-way ANOVA)及LSD两两比较;如方差不齐,则采用Welch近似方差分析及Dunnett's T3两两比较;相关分析数据总体符合双变量正态分布采用Pearson相关系数表示,不符合双变量正态分布的采用Spearman相关系数表示。所有统计分析中,检验水准a=0.05。 [结果] 1.正常组、肝纤维化组、肝硬化组趋化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25含量 1.1正常组、肝纤维化组、肝硬化组的CCL2含量分别为(0.46±0.34)、(19.30±4.26)和(81.23±11.47)pg/mg;肝硬化组的含量高于正常组(P=0.000)和肝纤维化组(P=0.000),肝纤维化组的含量高于正常组(P=0.000)。 1.2正常组、肝纤维化组、肝硬化组的CCL5含量分别为(0.30±0.37)、(0.88±0.52)和(3.75±1.45)pg/mg;肝硬化组的含量高于正常组(P=0.000)和肝纤维化组(P=0.000),肝纤维化组的含量于正常组差异无统计学意义(P=0.200)。 1.3正常组、肝纤维化组、肝硬化组的CCL7含量分别为(2.03±1.14)、(5.09±1.51)和(4.57±1.42)pg/mg。肝纤维化组(P=0.000)和肝硬化组(P=0.000)含量显著高于正常组,肝硬化组的含量低于肝纤维化组,但肝硬化组与肝纤维化组的差异无统计学意义(P=0.390)。 1.4正常组、肝纤维化组、肝硬化组的CCL21含量分别为(0.14±0.21)、(0.92±0.69)和(3.22±1.45)pg/mg;肝硬化组的含量高于正常组(P=0.000)和肝纤维化组(P=0.000),肝纤维化组和正常组CCL21的含量差异无统计学意义(P=0.092)。 1.5正常组、肝纤维化组、肝硬化组的CCL25含量分别为(4.06±2.23)、(14.46±4.10)和(21.97±2.98)pg/mg;肝硬化组的含量高于正常组(P=0.000)和肝纤维化组(P=0.000),肝纤维化组的含量高于正常组(P=0.000)。 2.肝组织中趋化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25含量与肝脏生化功能指标的相关性分析结果 2.1 CCL2、CCL5、CCL21和CCL25与ALT、AST的相关性分析具有统计学意义(P0.05), CCL2、CCL5、CCL21和CCL25与PT的相关性分析亦具有统计学意义,但相关系数均较小。 2.2 CCL7与AST相关性分析具有统计学意义,但相关系数亦较小;与肝功能余指标相关性分析无统计学意义。 3肝内趋化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25相互间的相关性分析表明,CCL2与CCL5、CCL21、CCL25间的相关系数(r)均在0.812以上,且相关性具有统计学意义(P0.01); CCL5与CCL21和CCL25的相关系数分别为0.584(P0.01)、0.788 (P0.01); CCL21与CCL25的相关系数为0.728(P0.01);但CCL7除与CCL25相关性(r=0.550)具有统计学意义外,与其他趋化因子相关性无统计学意义。 [结论] 1.本研究的观察结果表明,肝脏不仅有CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25表达,而且在肝脏发生纤维增生性损害时,肝内表达这些趋化因子的数量显著增加。随着肝损伤程度的加重,肝内趋化因子的含量逐步增加,至肝纤维化阶段,肝内CCL7的含量达到高峰。至肝硬化阶段,肝内CCL2、CCL5、CCL21、CCL25的含量达到高峰。但是这些趋化因子在肝脏发生纤维性损伤时出现表达上调的意义及其在BMDLSC向肝脏迁移过程中的调控作用有待进一步探索。 2.肝内趋化因子的含量与肝功能指标的相关分析表明:CCL2、CCL5、CCL21和CCL25在肝脏的表达数量与ALT和AST的变化呈显著性正相关,提示这四种趋化因子在肝脏的表达水平也可以作为判断有无肝脏损伤的指标。肝细胞受到损伤时,肝脏表达这四种趋化因子的表达数量增多;CCL7在肝脏的含量虽然也与ALT和AST的变化呈正相关,但相关系数仅0.337和0.380,提示CCL7在肝脏的含量高低与肝脏有无细胞损伤的关系不大,CCL7不能作为判断有无肝脏损伤的指标。 3. CCL2、CCL5、CCL7、CCL21、CCL25这五种趋化因子之间的相关性分析显示,CCL2、CCL5、CCL21、CCL25这四种趋化因子之间相关系数均在0.728以上,且具有统计学意义,提示这四种趋化因子的表达机制可能存在相似之处;CCL7与CCL2、CCL5、CCL21、CCL25相关性分析中仅与CCL25的具有统计学意义,但相关系数r仅为0.550,与CCL2、CCL5、CCL21的相关系数均不具统计学意义,提示CCL7的表达调控可能不同于其它趋化因子的表达调控。


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