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CADM1/TSLC1级联基因甲基化与大肠癌发生发展的关系研究

陈科全  
【摘要】: 背景和目的: 大肠癌(Colorectal cancer,CRC)是结肠癌和直肠癌的总称,是最常见的消化道恶性肿瘤之一。该病发生发展涉及多种基因的改变,这些基因主要包括三类基因:癌基因、抑癌基因和DNA修复基因。越来越多的研究证据表明,许多抑癌基因启动子区5’端CpG岛的过度甲基化导致基因表达灭活。最近研究还发现对人粪便标本进行检测抑癌基因启动子甲基化情况,可作为一个可行的大肠癌筛查表观遗传学生物学标记。因此,深入研究抑癌基因表观遗传修饰,对阐明大肠癌发病的分子机制、诊断、治疗及预后均有重要意义,而且可能成为未来治疗肿瘤的作用靶点。细胞粘附分子1/肺癌抑制因子-1(CADM1/TSLC1)是在对肺癌研究中发现的抑癌基因,属于免疫球蛋白超家族成员并与神经细胞粘附分子同源,该基因能明显抑制癌细胞的生长、通过非依赖钙镁离子途径的亲合反应介导细胞与细胞的粘附和细胞信号的转导。CADM1/TSLC1还能诱导免疫细胞识别和杀死肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞凋亡和抑制细胞增殖。CADM1/TSLC1已被证明在人体正常组织中广泛表达,而在许多癌症组织中表达减少;该基因启动子的过甲基化是导致其表达减少的一个重要机制。肺腺癌差异表达分子-1(DAL-1/4.1B/EPB41L3)是一类细胞膜骨架蛋白,包含有保守的4.1蛋白/埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白(FERM)区域,能与CADM1/TSLC1胞质结构域相互作用锚连接肌动蛋白。DAL-1/4.1B/EPB41L3存在于小鼠小肠上皮细胞的基底外侧膜上,且免疫组化结果显示该基因与小肠上皮细胞移位和增殖显著相关DAL-1/4.1B/EPB41L3表达缺失会导致细胞间粘附作用下降,重新使细胞表达DAL-1/4.1B/EPB41L3蛋白能增加细胞粘附性及诱导细胞凋亡。在对人非小细胞肺癌的研究中发现,DAL-1/4.1B/EPB41L3表达与相应癌旁组织比较在癌组织中明显减少,该基因表达缺失也存在于人脑膜瘤、室管膜瘤及乳腺癌,这意味着DAL-1/4.1B/EPB41L3在肿瘤发病机制中发挥重要作用。在肺癌、肾透明细胞癌、乳腺癌中的研究结果均显示DAL-1/4.1B/EPB41L3基因表达减少主要由其启动子异常甲基化导致。果蝇肿瘤抑制因子同源分子-3(MPP3)属于膜相关鸟苷酸激酶分子(MAGUKs)胞浆蛋白家族,能与CADM1/TSLC1含有一个羧基末端(PSD-95/Dlg/ZO-1) PDZ结合基因序列相结合,发挥调节细胞极性及细胞间粘附的作用。MPP3表达缺失可能导致CADM1/TSLC1抑癌通路的作用失活。研究发现在包括非小细胞肺癌的多种人类癌症中,MPP3基因染色体位点常常存在基因杂合性缺失,这是MPP3失活的其中一个机制。因此,CADM1/TSLC1、DAL-1/4.1B/EPB41L3及MPP3基因共同构成了在上皮细胞内发挥级联抑癌作用的通路,CADM1/TSLC1 PDZ结合亚基、DAL-1/4.1B/EPB41L3蛋白核心FERM区域和MPP3相互连接形成的三聚体在维持正常组织结构、细胞间粘附、细胞极性及形态发挥举足轻重的作用,该通路失活可能导致肿瘤发病及发展,且启动子甲基化可能是调控该通路的一个重要分子机制。材料和方法: 1)大肠癌细胞系培养和大肠癌组织标本的收集:大肠癌细胞系(SW480、HT29、COLO205、SW1116、SW620、LOVO、HCT116、HCT8)在10%FBS的RPMI-1640培养基培养;收集54例大肠癌及癌旁非癌组织标本分别行两种方法预处理:1)置入组织保存液,-80℃低温冰箱保存;2)常规10%中性福尔马林固定; 2) RT-PCR法检测基因mRNA表达:抽提各细胞系及组织标本总RNA,合成cDNA, PCR反应、琼脂糖凝胶电泳及半定量分析CADM1/TSLC1、DAL-1/4.1B/EPB41L3及MPP3基因mRNA水平表达; 3) Western Blotting法检测基因蛋白表达:提取各细胞系及组织标本总蛋白,测定蛋白浓度,变性蛋白、蛋白上样电泳、转膜、封闭、分别与一抗和二抗结合反应、最后ECL化学发光法检测并半定量分析CADM1/TSLC1、DAL-1/4.1B/EPB41L3及MPP3基因蛋白水平表达; 4)BSP法和MSP法检测基因启动子甲基化状态:提取细胞系及组织标本基因组DNA、亚硫酸氢盐修饰、BSP及MSP法扩增含有CpG岛的DNA片段、检测CADM1/TSLC1、DAL-1/4.1B/EPB41L3及MPP3基因启动子甲基化位点状况;BSP法和MSP法检测细胞系基因启动子甲基化情况,MSP法检测组织标本基因启动子甲基化情况; 5)免疫组化法检测组织标本CADM1/TSLC1蛋白表达:组织脱水、透明、浸蜡、包埋、制片、脱蜡、水化、抗原修复、分别与一抗和二抗结合反应、DAB显色、苏木素复染、切片脱水、透明及封片; 6)5-aza-dC处理大肠癌细胞系:先把105/ml大肠癌细胞系接种于六孔板中,配制10μM5-aza-dC在第2及第5天作用于细胞,空白对照组用PBS代替5-aza-dC,在第8天收集细胞。用RT-PCR法及Western Blotting法检测各细胞系CADM1/TSLC1、DAL-1/4.1B/EPB41L3及MPP3mRNA及蛋白表达变化情况。 7)统计学分析:运用SPSS13.0软件进行统计学分析。运用One Way ANOVA检验和独立样本T检验比较目的基因表达水平。分别运用Chi-Square检验、Fisher's精确检验和独立样本T检验分析启动子甲基化与基因表达水平以及临床特征的关系。 结果: 1) CADM1/TSLC1与大肠癌的关系:CADM1/TSLC1mRNA在3个大肠癌细胞系(SW480、HT29和COLO205)表达缺失;在4个细胞系(SW620、LoVo、HCT116和HCT8)中CADM1/TSLC1 mRNA表达减少。在18/54(33%)大肠癌组织中CADM1/TSLC1表达缺失,在21/54(39%)大肠癌组织中CADM1/TSLC1表达明显减少。免疫组化结果示CADM1/TSLC1蛋白在细胞膜及细胞浆均有表达,在非癌组织中可见胞膜表达,但在癌组织中以胞浆染色为主。2/8大肠癌细胞系(SW480、HT29)检测到全甲基化,且CADM1/TSLC1表达缺失。4/8大肠癌细胞系(HCT116、HCT8、SW620、LoVo)检测到部分甲基化,且CADM1/TSLC1表达减少。在5-aza-dC作用后,SW480和HT29细胞系出现CADM1/TSLC1表达。在29/39(74%)例大肠癌组织中检测到CADM1/TSLC1基因启动子甲基化,且CADM1/TSLC1mRNA表达均减少或缺失。在26/32(81%)例进展期肿瘤(T3和T4期)检测到CADM1/TSLC1基因启动子甲基化,而在6/32(19%)例早期肿瘤(T1和T2期)检测到CADM1/TSLC1基因启动子甲基化,两组比较差异显著(X2=4.459,P=0.035)。除此之外,Dukes'C期和Dukes'D期大肠癌患者CADM1/TSLC1基因启动子甲基化频率显著高于Dukes'A期和Dukes'B期患者(X2=6.480,P=0.011); 2)DAL-1/4.1B/EPB41L3与大肠癌的关系:DAL-1/4.1B/EPB41L3mRNA在6株大肠癌细胞系(SW480、HT29、COLO205、SW1116、SW620、LOVO)中均有表达,各细胞系间表达均无明显差异。DAL-1/4.1B/EPB41L3启动子CpG位点均为非甲基化。5-aza-dC作用6株大肠癌细胞系后,发现DAL-1/4.1B/EPB41L3mRNA表达无明显改变。DAL-1/4.1B/EPB41L3 mRNA有5/21(24%)例大肠癌组织DAL-1/4.1B/EPB41L3 mRNA表达缺失。2/21(10%)例大肠癌组织DAL-1/4.1B/EPB41L3启动子出现甲基化条带。结果表明在大肠癌中DAL-1/4.1B/EPB41L3启动子甲基化是少见现象,存在其他沉默DAL-1/4.1B/EPB41L3表达的分子机制; 3)MPP3与大肠癌的关系:MPP3在2株大肠癌细胞系(SW1116、LoVo)表达缺失,这两株大肠癌细胞系(SW1116、LoVo)均存在MPP3启动子甲基化状态。运用5-aza-dC作用这2株大肠癌细胞系后,发现SW1116、LoVo细胞系的MPP3均恢复表达。在10/23(43%)例大肠癌组织中MPP3表达缺失,MPP3表达水平在大肠癌组织中显著减少(X2=7.216,P=0.007)。在8/23例(35%)大肠癌组织中检测到MPP3基因启动子甲基化,且这8例组织中MPP3mRNA表达均缺失。MPP3启动子甲基化在8/14例进展期肿瘤(T3和T4期)检测到,而在1/9例早期肿瘤(T1和T2期)检测到,两组比较差异显著(P=0.040)。在Dukes'C、D分期中MPP3与CADM1/TSLC1启动子甲基化相关(P=0.021)。MPP3和/或CADM1/TSLC1启动子甲基化在10/14例进展期肿瘤(T3和T4期)检测到基因启动子甲基化,而在1/9例早期肿瘤(T1和T2期)检测到基因启动子甲基化,两组比较差异显著(P=0.009)。 结论: 1) CADM1/TSLC1与大肠癌的关系:在大肠癌中,CADM1/TSLC1表达减少可能是导致该病发生发展的重要分子机制之一。启动子甲基化是导致CADM1/TSLC1基因沉默的主要机制。CADM1/TSLC1启动子甲基化在进展期大肠癌(T3,T4)比早期大肠癌(Tis,T1,T2)更常见,这表明CADM1/TSLC1可能抑制肿瘤的侵袭和生长;CADM1/TSLC1启动子甲基化在Dukes'C和D期比Dukes'A和B期更常见,这表明启动子甲基化导致CADM1/TSLC1沉默可能增加大肠癌的恶性程度。CADM1/TSLC1启动子甲基化是去甲基化药物作用的一个有效靶目标。 2) DAL-1/4.1B/EPB41L3与大肠癌的关系:我们在检测6株大肠癌细胞系DAL-1/4.1B/EPB41L3mRNA情况时,发现该基因表达并没有明显减少;但在检测21例大肠癌组织样本时,该基因表达则在24%癌组织中表达缺失,而相应癌旁组织均有该基因正常表达。结果提出两方面问题:1)除了上述用于研究的6株大肠癌细胞系以外,可能存在DAL-1/4.1B/EPB41L3mRNA表达减少的其他大肠癌细胞系,可选用于进一步研究;2)由于在SW480、HT29、COLO205、SW620及LOVO大肠癌细胞系中,均检测到不同程度的CADM1/TSLC1表达减少,提示CADM1/TSLC1与DAL-1/4.1B/EPB41L3结合形成二聚体的分子数量也相应减少,这可能会使DAL-1/4.1B/EPB41L3蛋白表达量在没有明显减少的情况下,但其蛋白的膜定位错误,而丧失其与膜蛋白相互作用发挥抑癌基因的功能,导致正常细胞向癌细胞特征转变,但这需要进一步研究细胞系中DAL-1/4.1B/EPB41L3蛋白表达定位情况。大肠癌组织样本中该基因表达减少的实验结果则提示DAL-1/4.1B/EPB41L3在大肠癌中可能发挥重要的作用。大肠癌中DAL-1/4.1B/EPB41L3表达减少,可能会使大肠癌细胞增殖能力、肿瘤的浸润生长能力、抗凋亡能力及远处转移能力均增强,导致肿瘤恶性程度增加。在大肠癌发生发展中,基因启动子甲基化可能并不是DAL-1/4.1B/EPB41L3表达减少的主要机制。 3)MPP3与大肠癌的关系:在大肠癌中,MPP3表达减少可能是导致该病发生发展的重要分子机制之一。而启动子甲基化是导致MPP3基因沉默的主要机制。MPP3启动子甲基化在进展期肿瘤(T3和T4期)发生率比早期肿瘤(T1和T2期)常见,提示MPP3缺失能导致肿瘤细胞的浸润。在Dukes'C、D分期中MPP3与CADM1/TSLC1启动子甲基化具有相关性,我们推测在一部分大肠癌发展到Dukes'C、D期时,MPP3基因启动子和CADM1/TSLC1基因启动子可能同时发生甲基化,这样可能会导致MPP3与CADM1/TSLC1蛋白的抑癌功能同时丧失,更进一步破坏CADM1/TSLC1级联通路的抑癌功能,使病情进一步恶化。在对MPP3和/或CADM1/TSLC1启动子甲基化发生率在进展期肿瘤(T3和T4期)比早期肿瘤(T1和T2期)常见,结果提示对上述两个基因的启动子进行检测可能预测大肠癌患者肿瘤浸润范围,为临床治疗方法的选择提供参考。综上所述,研究结果表明CADM1/TSLC1级联通路抑癌基因表达改变在大肠癌中是重要事件,因此在人大肠癌发病机制发挥重要作用。在大肠癌组织中可以检测到MPP3和CADM1/TSLC1启动子甲基化频繁发生,特别是在T3和T4期大肠癌患者,这为临床诊断大肠癌浸润程度提供理论依据,也为去甲基化药物治疗大肠癌提供一个新的作用靶目标,运用去甲基化药物恢复MPP3和CADM1/TSLC1表达可能对治疗大肠癌有效。


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