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促炎症细胞因子HMGB1在支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病表达变化和临床意义

侯长春  
【摘要】: 研究背景及意义: 支气管哮喘(简称哮喘)是一种严重危害人类健康的慢性呼吸道疾病,以气道慢性炎症、粘液分泌增加、气道反应性增高及气道重塑为主要特征。慢性阻塞肺疾病(COPD)也是一个重大的公共卫生问题,COPD的死亡率目前居全球死因第四位。慢性炎症在支气管哮喘和COPD的发病过程中扮演着关键角色。而细胞因子在促进哮喘和COPD的慢性炎症和呼吸道结构变化过程起重要作用,研究发现在哮喘和COPD的诱导痰和支气管肺泡灌洗液中促炎症细胞因子如TNF-α,IL-1β和IL-6等显著升高,这些因子进一步扩大炎症反应。目前认为:慢性气道炎症是哮喘和COPD的共同特征,但两者炎症特点存在明显不同。 高迁移率族蛋白1(HMGB1)是一个新发现的具有显著促炎效应的细胞因子 HMGB1是在细胞核细胞质中广泛存在的DNA的结合蛋白,参与维持核酸结构、调节基因转录等。近年来在动物模型和人类疾病的研究上发现HMGB1释放到胞外后发挥促炎症细胞因子的功能。HMGB1可以从激活的免疫细胞如:单核巨噬细胞中释放出来,也能够从损伤和坏死的细胞被动释放出来,激发“坏死诱导炎症”HMGB1可以诱导许多炎症因子如TNF-α,IL-I,IL-6和IL-8等的释放,也能激活人内皮细胞,导致其粘附分子的表达上调。在细胞系和动物模型的研究发现,HMGB1主要与TLR 2,TLR 4和RAGE三种受体相互作用,进而导致NF-κB通路活化,参与免疫、炎症调节。在脓毒血症、内毒素血症、关节炎动物模型上发现,应用HMGB1抗体可以起到保护作用。在脓毒血症、类风湿关节炎等炎症状态下,HMGB1在血浆中显著升高。 许多的细胞因子如TNF-α,IL-1β在哮喘、COPD中表达升高,同时这些因子可以诱导HMGB1从免疫细胞如单核巨噬细胞释放出来。因此推测HMGB1可能参与了哮喘和COPD的发病,但目前关于HMGB1在哮喘和COPD中的表达和作用研究尚鲜见报道。本研究旨在探讨HMGB1在哮喘和COPD诱导痰和血浆中的表达变化及差异,探讨HMGB1表达水平与疾病严重程度及炎症表型的关系,进一步在OVA致敏的哮喘模型研究HMGB1在支气管肺泡灌洗液和肺组织的表达情况,以初步明确HMGB1在哮喘及COPD的表达情况和临床意义。 方法: 一、临床实验 1、确定哮喘和COPD患者入组标准和排除标准。 2、收集患者基本资料和行肺功能检查。 3、收集和处理患者诱导痰和外周血标本 4、ELISA法检测患者的血浆和诱导痰中HMGB1的表达水平。 二、动物实验 哮喘小鼠模型肺组织和支气管肺泡灌洗液HMGB1的表达变化 18只雌性BALB/c小鼠应用随机数字表进行随机化的分组分为3组:对照组,OVA组(哮喘组),OVA/DM组(地塞米松组)。 无创肺功能检测小鼠气道反应性:不同浓度乙酰甲胆碱(Sigma; 0,3.125, 6.25,12.5,25 and 50 mg/ml溶解在等渗生理盐水)激发,BUXCO无创肺功能检测仪检测Penh值。 小鼠气管灌洗液细胞分类计数:PBS灌洗,灌洗液上清ELISA法检测细胞因子HMGB1;灌洗液离心沉淀细胞计数,苏木素-伊红(HE)染色细胞分类计数。ELISA检测小鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ、HMGB1含量。 小鼠肺脏组织病理观察:取出小鼠肺组织、固定,然后脱水、石蜡包埋、切片、苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠肺脏病理变化。 小鼠肺脏组织HMGB1蛋白western blotting检测,Quantity One软件分析HMGB1的相对表达量。 三、统计学处理 采用SPSS13.0软件进行统计分析,资料以均数±标准差(x±s)表示。方差齐时,总体均数的比较采用单向方差分析(one-way ANOVA),各组间多重比较采用LSD法和SNK法检验,方差不齐时总体均数的比较采用Welkch法,各组间多重比较采用Dunnett's T3法检验。样本率和构成比比较用x2检验。相关分析采用Spearman相关分析.以P0.05为有统计学意义。结果: 一、临床实验结果 1、共收集30例对照组、51例哮喘患者、49例COPD患者样本。 2、COPD组血浆HMGB1的浓度(11.86±6.81 ng/ml)显著高于哮喘组(6.22±4.04 ng/ml)和对照组(4.14±1.65 ng/ml)(p=0.000):与对照组比较,哮喘组血浆HMGB1的浓度显著升高(p0.005)。COPD组诱导痰的HMGB1的浓度(15.51±10.81 ng/ml)显著高于哮喘组(4.45±3.44 ng/ml)和对照组(1.01±1.61 ng/ml)(p=0.000);与对照组比较,哮喘组血浆HMGB1的浓度显著升高(p=0.000)。 3、急性发作期COPD患者血浆HMGB1的浓度(10.91±6.04 ng/ml)与稳定期COPD(12.86±6.99 ng/ml)比较无差别(p=0.974)。急性发作期COPD患者诱导痰HMGB1的浓度(20.06±10.61 ng/ml)显著高于稳定期COPD患者(11.14±9.25 ng/ml) (p=0.029)。 4、不同严重度的哮喘患者的诱导痰、血浆的HMGB1的浓度比较无差异性。不同严重度COPD病人血浆HMGB1的浓度比较无差异性。重度COPD患者(17.83±10.33 ng/ml)和极重度COPD病人(17.76±10.55ng/ml)诱导痰HMGB1的浓度显著高于中度COPD组(p=0.002)。 5、血浆HMGB1浓度与肺功能指标呈现显著负相关:FVC(r=-0.486,p=0.000);PEF(r=-0.545, p=0.000);FEV1(r=-0.514,p=0.000);FEV1%(r=-0.447, p=0.000);FEV1/FVC(r=-0.437, p=0.000)。诱导痰HMGB1浓度与肺功能指标呈现显著负相关:FVC(r=-0.604, p=0.000);(r=-.684, p=0.000);FEV1 (r=-0.685,p=0.000);FEV1%(r=-0.658,p=0.000);FEV1/FVC(r=-0.601, p=0.000)。血浆HMGBl浓度与血中中性粒细胞绝对值(r=0.324,p=0.001)和百分比(r=0.374,p=0.000)显著正相关,诱导痰HMGB1浓度与诱导痰中性粒细胞绝对值(r=0.504,p=0.000)和百分比(r=0.593,p=0.000)显著正相关。 二、动物实验结果 1.随着乙酰甲胆碱浓度上升各组小鼠气道反应性检测指标Penh值均出现上升趋势,OVA组小鼠的气道反应性最高。乙酰甲胆碱激发浓度为6.25 mg/ml时,OVA组小鼠气道反应性%基线Penh值(419.94±72.57)和OVA/DM组(285.48±118.43)比对照组(286.16±96.49)高(P0.05);与OVA组比较,OVA/DM治疗组%基线Penh值显著降低(P<0.05)。2.OVA组小鼠支气管肺泡灌洗液IL-4浓度(66.25±18.07 pg/ml)比对照组(38.30±9.60pg/ml)高(P0.01),OVA/DM组IL-4水平降低(P0.01);OVA组小鼠支气管肺泡灌洗液IFN-γ(6.31±2.17 pg/ml)与对照组(14.41±7.65 pg/ml)比较无显著差异(P=0.124),与OVA/DM组(9.86±1.77 pg/ml)比较显著降低(P<0.05)。 3.小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中:与对照组比较(3.48±0.51)×105/ml,OVA组细胞总数(7.92±1.02)×105/ml显著增高(P0.01);与对照组比较(1.50±1.06),OVA组嗜酸性粒细胞百分比(46.17±14.09)显著增高(P0.01)。 支气管肺泡灌洗液检测HMGB1结果:OVA组支气管肺泡灌洗液中HMGB1含量(6.31±4.05 ng/ml)显著高于对照组(2.59±0.73ng/ml)(P=0.017),与OVA组比较,OVA/DM组(3.39±0.50 ng/ml)小鼠支气管肺泡灌洗液HMGB1含量无显著降低(P=0.052)。 4.常规HE染色OVA组支气管上皮增生肥厚、粘液分泌增加、管腔明显狭窄,管壁及其周围大量嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润,地塞米松治疗后可使炎症减轻。 5.Western blotting检测发现OVA组小鼠肺组织HMGB1相对表达量(HMGB1/TUBULIN)(2.08±0.87)显著高于对照组(0.93±0.18)(P0.05);与OVA组比较,OVA/DM组小鼠肺脏HMGB1表达量(1.15±0.48)无显著减低(P=0.133)。 结论: 1、哮喘和COPD患者血浆和诱导痰中的HMGB1含量均显著增高,提示HMGB1可能参与了哮喘和COPD的发病过程。 2、在急性加重期的COPD患者,HMGB1的含量显著增高,提示HMGB1在COPD的急性加重期有一定作用。同时血浆和诱导痰中HMGB1的含量与肺功能指标显著负相关,提示HMGB1可能是反映COPD严重程度的新的标记物。 3、在COPD患者中,血浆的HMGB1的含量与外周血的中性粒细胞数量呈显著正相关,诱导痰中HMGB1含量与痰中的中性粒细胞的含量呈显著正相关,我们推测中性粒细胞可能是HMGB1的重要的来源。 4、哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液和肺组织的HMGB1含量均显著升高,提示HMGB1可能参与哮喘慢性炎症过程。


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