雌激素缺乏对大鼠颅内动脉瘤形成影响的实验研究

【摘要】： 研究背景 颅内动脉瘤破裂是神经外科最常见的急诊疾病之一,是蛛网膜下腔出血的首要原因,占60%左右。其发病前无明显预兆,发病急,症状重,死亡率及致残率高。国外文献报道颅内动脉瘤破裂所致的蛛网膜下腔出血的发病率每年6-21／100,000人。脑血管病是我国居民的第二位死因,1998年卫生部统计我国脑血管病死亡人数城市达137.72／10万,农村地区达113.05／10万。颅内动脉瘤破裂所致死亡率可达50%,约25%的患者将遭受偏瘫、失语、失明等永久性的残疾,而且生存下来的患者动脉瘤有随时破裂的可能。另有人统计第一次出血死亡率可高达40%,第二次出血死亡率可达60%。综合文献报道初次出血24小时内出血率最高,达4.1%,以后每天下降为1.5%,1个月后再出血率锐减,大约为每年3-4%。未破裂动脉瘤每年发生再次的危险介与1-2%之间。所以对于颅内动脉瘤,应积极予以治疗。目前常用的治疗方法有两种：一种是显微神经外科手术夹闭动脉瘤瘤颈,使动脉瘤置于血液循环外,避开血流冲击,从而避免动脉瘤再次破裂；另一种是血管内介入治疗技术,通过导管将栓塞材料填塞于动脉瘤瘤腔内,避开血流冲击。近年来,神经内境,神经导航系统等应用提高了显微外科手术的疗效；随着影像学的不断发展,介入新材料的出现,血管内治疗动脉瘤的疗效也越来越好,有部分学者提出将栓塞治疗作为颅内动脉瘤的首选治疗方法。 随着医疗技术的不断发展,对颅内动脉瘤的临床治疗已经取得了很大的发展,但对其形成、生长、破裂的机制还不很清楚。动脉瘤的发病是多因素的,通常按其不同病因分为5类：①先天性动脉瘤；②感染性动脉瘤；③外伤性动脉瘤；④动脉硬化性动脉瘤；⑤剥离性动脉瘤。其中绝大部分是“先天性动脉瘤”,即通常称之为囊性动脉瘤(saccular aneurysm)或浆果样动脉瘤(berry aneurysm)。动脉瘤的病因大概可以分为三类：遗传或先天性因素致病的先天学说、颅内动脉获得性退行性病变导致血管破坏的后天学说和综合学说。近年来人们试图通过对动脉瘤动物模型的研究,揭示颅内动脉瘤的病因发病机理,为临床研究提供条件。而如何设计和制作与人体动脉瘤生理特性相一致的动脉瘤动物模型是开展此类研究的基础、难点和关键。目前制作动脉瘤模型的主要方法主要有：外科手术移植法、动脉局部破坏法、酶破环血管壁法、血管内介入法,病因诱导法等。 现在比较公认的动脉瘤常见发病危险因素有吸烟、酗酒、高血压,这些危险因素在男性中比在女性中更普遍,但流行病学资料显示,女性特别是绝经后发病率明显高于男性(ratio:60/40),大多女性患者集中在50-59岁年龄段。流行病学资料调查显示,颅内动脉瘤患者39岁以下女性占44%,40—49岁女性占55%,50—59岁女性占到77%。W. T. Longstreth等研究也发现,女性绝经前的蛛网膜下腔出血发病率要比绝经后低(odds ratio,0.24;CI,0.09-0.68),长期或经常服用雌激素替代治疗的绝经后女性比不服用雌激素绝经后女性发病率会降低(p0.002)。 第一部分：低雌激素水平模型、动脉瘤模型的制作及标本的获取和初步研究目的 建立雌激素缺乏的动脉瘤模型,并且在此基础上初步研究雌激素缺乏对颅内动脉瘤形成及生长的影响及可能机制。 方法 雌性Wistar大鼠30只,随机分为实验组、实验对照组、空白对照组,各10只。实验组：切除双侧卵巢+动脉瘤模型；实验对照组：切除双侧卵巢旁与其大小相当的一块脂肪+动脉瘤模型；空白对照组：不做任何处理。大鼠去势模型或腹部假手术模型制作后2周后,用猪胰弹性蛋白酶(E1250 Sigma)滴加到颈外动脉及分叉处动脉壁周围,在颈外动脉距分叉处约1.5mm位点,用两根手术线结扎颈外动脉,在两根线之间剪断颈外动脉,使颈外动脉的盲段形成颈内动脉的一个动脉瘤。动脉瘤模型制作6周后,快速打开大鼠胸腔暴露心脏,右心房取全血2ml,离心、取上清液后于-20℃冰箱保存,用于检测大鼠血清中雌激素的含量；同时取实验组及实验对照组的动脉瘤组织和空白对照组相应的一段颈外动脉组织,用于常规组织切片染色。 结果 血浆中雌激素水平实验组为(105.00±12.96)pmol/L,实验对照组为(178.50±25.96)pmol/L,空白对照组(180.40±18.70)pmol/L；实验组与实验对照组及空白对照组分别比较(p0.01),与两组差异有统计学意义。实验组动脉瘤长度扩张率(131.31±6.63)%,实验对照组动脉瘤长度扩张率(109.90±3.44)％,Z=9.061,p0.01,.实验组动脉瘤直径扩张率(125.10±5.49)%,实验对照组动脉瘤直径扩张率(106.82±2.49)％,t=9.597,p0.01. 结论 雌激素缺乏对颅内动脉瘤的形成、生长有一定的促进作用,本研究使用盲段法结合酶消化法制作动脉瘤模型简便可行。 第二部分雌激素缺乏对大鼠颅内动脉瘤组织MMP-9表达影响的研究 目的 应用第一部分所取得的动脉瘤组织标本,初步研究雌激素缺乏对动脉瘤组织MMP-9表达的影响。 方法 1.免疫荧光：从-20℃箱取出组织切片,室温下晾干,清洗；然后加4%多聚甲醛固定,0.01M PBS液清洗,加入配好的5%山羊血清封闭,然后分别加一抗兔抗Anti-MMP-9(1:400),放置于4℃湿盒过夜；0.01M PBS液再清洗三次；加入羊抗兔IgG(绿色,1：400)荧光标记二抗、室温避光1小时；再0.01MPBS液清洗3次；滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查,或放入4℃冰箱保存待尽早观察。 2. western Blot:首先测定样本蛋白的浓度然后进行,清洗玻璃板,灌胶与上样,电泳,加一抗、二抗进行免疫反应化学发光,最后显影,定影. 结果 免疫荧光：在动脉瘤血管壁可见MMP-9阳性细胞主要位于动脉壁中、外膜,实验组较对空白对照组、实验对照组均明显。western blot：在动脉瘤血管壁中都有MMP-9蛋白的存在,实验组较实验对照组量多,空白对照组最少。 结论 雌激素缺乏能够促进动脉瘤组织中MMP-9蛋白的表达,从而促进血管壁的力纤维和胶原纤维降解、从而促进动脉瘤的形成及生长。