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隐匿性HBV感染和经抗病毒治疗HBsAg清除者的细胞免疫应答特点的研究

梁敏锋  
【摘要】: 目的 隐匿性HBV感染是HBV感染状态中的一个特殊阶段,其发生机制一直未能明确,病毒变异、宿主免疫应答、合并其他病原体感染、表观遗传学改变都是这个特殊感染状态发生的可能机制。同时,慢性乙型肝炎患者经有效的抗病毒治疗可以达到HBsAg清除,外周血HBV DNA可能检测不到。这两类人群在临床血清学和病毒学指标上具有极大的相似之处。部分HBsAg清除的慢乙肝患者从某个程度上说可能属于隐匿性HBV感染,而隐匿性HBV感染者的来源可以是急性肝炎恢复的患者、慢性乙型肝炎的治愈患者和HBsAg自然转阴的慢性HBV携带者。然而,目前对于这两种人群的HBV特异性细胞免疫学特点的报道尚缺乏。而明确这两者的HBV特异性细胞免疫学特点,可能有助于我们更深入地认识隐匿性HBV感染的发生机制,以及洞察细胞免疫学因素在慢性乙型肝炎患者经有效抗病毒治疗达到HBsAg清除的过程中发挥的相应作用。 方法 1.通过更敏感的化学发光微粒免疫法重新检测982份合格献血员的血浆,从中发现HBsAg≥0.05 IU/mL的标本;提取这些标本的HBV DNA,用诊断性PCR对HBV S、C和X区进行扩增,凡2个或以上区段扩增阳性的标本,可诊断为隐匿性HBV感染。在此基础上,对部分扩增阳性的标本进行基因型分析和“a”决定簇变异分析。 2.从这些隐匿性HBV感染者中回访到6名献血员,并从门诊和住院患者中发现了3名隐匿性HBV感染者,与14名经抗病毒治疗达到HBsAg清除的慢乙肝治愈者进行细胞免疫学特点的分析。其中14名HBsAg清除者的血清HBVDNA也进行了基因型和病毒变异分析。 3.分离9名隐匿性HBV感染者和14名HBsAg清除者外周血单个核细胞(PBMC),用自行设计的涵盖S和C基因区的18-mer重叠多肽库(overlapping peptide pool)和重组HBsAg、HBcAg抗原作为特异性刺激物,通过酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测T细胞特异性分泌IFN-y的能力;再用上述合成的重叠多肽库作为特异性刺激物,刺激培养PBMC 6h,细胞内细胞因子染色(ICS)结合流式细胞术(FCM)检测特异性分泌IFN-y和IL-2的CD4/CD8 T细胞阳性频数,明确特异性分泌细胞因子的T细胞来源。ELISPOT检测IFN-y的斑点形成细胞数大于20 SFC/106 PBMC则视为阳性反应,阳性反应的平均SFC视为应答强度,阳性反应孔数占总体反应孔数的百分率视为应答反应性;ICS检测IFN-γ和IL-2的CD4/CD8+T细胞频数大于0.05%则视为阳性反应,阳性反应的平均细胞因子特异性CD4/CD8+T细胞频数视为应答强度,阳性反应孔数占总体反应孔数的百分率视为应答反应性。 4.此外,7例免疫耐受HBV携带者和9例非活动性HBsAg携带者也作为慢性HBV感染对照组纳入了本研究中分析细胞免疫学特点,所检测的细胞免疫学指标同上。 结果 1.通过化学发光微粒免疫法检测,发现64份血浆的HBsAg定量值≥0.05IU/mL,阳性率为6.5%(64/982)。64份HBsAg阳性标本,其中男性40份,女性24份;男、女献血员的平均年龄比较无显著差异(27±6VS.25±8,t=1.247,P=0.217)。64份HBsAg阳性血浆的平均HBsAg定量水平为0.28±0.27 IU/mL (0.05~1.14 IU/mL),其余918份血浆的平均HBsAg定量水平为0.02±0.01 IU/mL(0.00~0.04 IU/mL),两组间平均HBsAg定量水平的比较有统计学差异(Z=-14.332,P0.001),而ALT水平的比较则无显著差异(15.3±5.8VS.14.8±6.3,t=0.598,P=0.550),性别分布也无显著差异(χ2=0.054,P=0.816). 2.64份HBsAg定量阳性(0.05 IU/mL)血浆经敏感的巢式PCR方法扩增HBV不同区段的产物,各区的总体扩增效率分别为:S区扩增阳性19例(29.7%),C区扩增阳性41例(64.1%),X区扩增阳性42例(65.6%)。其中仅一各区段扩增阳性的标本分别是:1例S区阳性(1.6%),7例C区阳性(10.9%),4例X区阳性(6.2%)。两个区段以上同时阳性的标本分别是:12例三个区段均阳性(18.8%),21例C和X区同时阳性(32.8%),1例S和C区同时阳性(1.6%),5例S和X区同时阳性(7.8%)。此外,扩增全阴性标本有13例(20.3%)。按照隐匿性HBV感染的PCR诊断要求,只有两个或以上区段扩增阳性的标本,才能被诊断为隐匿性HBV感染。在本次研究中,我们发现39名血站合格献血员可被诊断为隐匿性HBV感染(4.0%,39/982)。 3.经序列比对分析,隐匿性HBV感染者S区扩增阳性的标本中并未发现“a=”决定簇的变异,特别是已有报道的热点变异位点。有测序结果的14份样品,经序列对比进行基因型分析,发现有6份为B型,其余8例为C型;在6名HBVDNA扩增阳性的HBsAg清除者中鉴定出5例为C型,1例为B型,均未发现“a”决定簇变异,但在2例C型患者中发现L80I、L180M和M204I三个位点联合变异。 4.在ELISPOT检测IFN-γ实验中,HBV特异性T细胞均可以在HBsAg清除者和隐匿性HBV感染者外周血PBMC中检测到,阳性反应孔的SFC频数范围分别为22~846 SFC/106 PBMC和22~504 SFC/106 PBMC,但两者的阳性应答率无显著差异(41.1% VS.33.3%,χ2=0.637,P=0.425),而且两者的阳性反应孔的平均SFC频数也无显著差异(113±36 vs.98±31,P=0.976)。HBsAg清除者阳性反应孔的平均SFC高于免疫耐受HBV携带者(P=0.031);隐匿性HBV感染者阳性反应孔的平均SFC高于免疫耐受HBV携带者(P=0.040)。此外,在HBsAg清除者组,rHBcAg比C多肽库诱导的HBV特异性T细胞应答更强烈(P=0.012),但在隐匿性HBV感染者组,则两种刺激物诱导的HBV特异性T细胞应答强度无显著差异(P=0.302)。rHBcAg诱导的HBsAg清除者总体HBV特异性T细胞应答强于隐匿性HBV感染者(P=0.010),与非活动性HBsAg携带者相当(P=-0.549),但强于免疫耐受HBV携带者(P=0.004)。血清阳性(anti-HBc阳性)隐匿性HBV感染者PBMC对S多肽库、rHBsAg和rHBcAg呈低反应性,但对C多肽库的反应性则较高(3/4);血清阴性(anti-HBc阴性)隐匿性HBV感染者PBMC对S多肽库、C多肽库和rHBcAg的反应性均较高(均为3/5),但应答强度较离散,而对rHBsAg的反应性则为2/5,且应答强度较低。 5.总的来说,HBsAg清除者和隐匿性HBV感染者的外周血T细胞中可检测到特异性分泌IFN-γ的CD8+和CD4+T细胞。HBsAg清除者与隐匿性HBV感染者的外周血IFN-γ+CD8+T细胞频数无显著差异(P=0.103),但两者的IFN-γ+CD4+T细胞频数有显著差异(P=0.047)。隐匿性HBV感染者IFN-γ+CD8+T细胞频数高于免疫耐受HBV携带者(P=0.011)。HBsAg清除者的IFN-γ+CD4+T细胞频数高于免疫耐受HBV携带者(P=0.023)。4个研究组的HBV特异性CD8+T细胞阳性应答强度的整体比较有显著差异(χ2=9.132,P=-0.024),而对S和C多肽库的反应性也不同。HBsAg清除者体外IFN-γ+CD8+T细胞频数体现出了对S和C多肽库的反应性不同:C多肽库的阳性反应率为78.6%(11/14,IFN-γ+CD8+T细胞频数范围:0.06%~0.24%,Median:0.10%),而S多肽库的阳性反应率为21.4%(3/14,IFN-γ+CD8+T细胞频数:0.08%、0.13%和0.24%)。隐匿性HBV感染者体外IFN-+CD8+T频数则未发现对S和C多肽库的反应性不同:C多肽库的阳性反应率为42.8%(3/7,IFN-γ+CD8+T细胞频数范围:0.08%~0.22%,Median:0.11%),S多肽库的阳性反应率为28.6%(2/7,IFN-γ+CD8+T细胞频数:0.27%和0.38%)。免疫耐受HBV携带者CD8+T细胞对S多肽库和C多肽库的反应率分别为3/7(IFN-γ+CD8+T细胞频数范围:0.06%~0.08%,Median:0.06%)和2/7(IFN-γ+CD8+T细胞频数:0.06%和0.07%);非活动性HBsAg携带者CD8+T细胞对S多肽库和C多肽库的反应率分别为4/9(IFN-γ+CD8+T细胞频数范围:0.08%~0.32%,Median:0.135%)和6/9(IFN-γ+CD8+T细胞频数范围:0.06%~0.23%,Median:0.085%).4个研究组的HBV特异性CD4+T细胞阳性应答强度的整体比较有显著差异(χ2=8.628, P=0.035),而对S和C多肽库的反应性也不同。4个研究组对S多肽库的HBV特异性CD4+T细胞总体应答(全部应答)进行整体比较并未发现统计学差异(χ2=4.241,P=0.237),但对C多肽库的总体应答的整体比较有显著统计学差异(χ2=12.881,P=0.005)。HBsAg清除者体外CD4+T细胞对S和C多肽库的反应性不同:C多肽库的阳性反应率为11/14,S多肽库的阳性反应率为4/14;尽管HBsAg清除者CD4+T细胞对两种刺激物的阳性应答强度无统计学差异(Z=-0.987,P=0.324),但是在总体应答强度上却有统计学差异(Z=-2.151,P=0.031)。隐匿性HBV感染者体外CD4+T细胞对S和C多肽库的反应性和应答强度均较低,分别为2/7(IFN-γ+CD4+T细胞频数:0.06%和0.07%)和3/7(IFN-γ+CD4+T细胞频数:0.06%、0.07%和0.10%);两种刺激物诱导的CD4+T细胞总体应答强度无统计学差异(Z=-0.355,P=0.723),而阳性应答强度也无统计学差异(Z=-0.609,P=0.543)。免疫耐受HBV携带者体外CD4+T细胞对C多肽库的刺激几无应答(0/7),因此无法用统计学方法与隐匿性HBV感染者及HBsAg清除者进行比较;而对S多肽的反应性相对较好(3/7),但应答强度也是偏低(0.06%、0.06%和0.07%)。HBsAg清除者体外CD4+T细胞对C多肽库的总体应答强度高于隐匿性HBV感染者和免疫耐受HBV携带者(Z=-2.254, P=0.024;Z=-3.257,P=0.001),与非活动性HBsAg携带者相当(Z=-0.823, P=0.411);但隐匿性HBV感染者体外CD4+T细胞对C多肽库的总体应答强度却与免疫耐受HBV携带者及非活动性HBsAg携带者相比无显著统计学差异(Z=-0.067,P=0.947;Z=-1.763,P=0.078)。血清阳性(anti-HBc阳性)隐匿性HBV感染者体外CD4+T细胞对S和C多肽库的刺激几无反应,仅有一人的CD8+T细胞对S多肽库的刺激有反应性。血清阴性(anti-HBc阴性)隐匿性HBV感染者体外CD4+T细胞对S和C多肽库的刺激均有反应(2/4和3/4),而CD8+T细胞对S和C多肽库的刺激反应则不同(1/4和3/4),针对C多肽库的CD4+和CD8+T细胞应答强度的比较无显著差异(Z=-1.528,P=0.127)。 6.我们发现全部检测对象经S或C多肽库刺激后胞内检测IL-2阳性T细胞应答具有非均一性。HBsAg清除者CD8+T细胞对S和C多肽库的反应性均不高(4/14和2/14);隐匿性HBV感染者CD8+T细胞对S多肽库稍有反应(2/7),而对C多肽库则无反应(0/7);免疫耐受HBV携带者CD8+T细胞对S多肽库的反应性较好(4/7),但对C多肽库的反应性偏低(1/7);非活动性HBsAg携带者CD8+T细胞对S多肽库的反应性较低(2/9),对C多肽库的反应性也较低(3/9)。HBsAg清除者CD4+T细胞对S和C多肽库的反应性均偏低(均为1/14);隐匿性HBV感染者CD4+T细胞对S多肽库稍有反应(1/7),而对C多肽库则无反应(0/7);免疫耐受HBV携带者CD4+T细胞对S多肽库的反应性较好(3/7),但对C多肽库的反应性偏低(1/7);非活动性HBsAg携带者CD4+T细胞对S多肽库的反应性较低(2/9),对C多肽库的反应性也较低(1/9)。用Kruskal-Wallis H test对CD8+T和CD4+T细胞应答进行统计分析,发现各组的IL-2+CD8+T细胞频数的整体比较有统计学差异(χ2=8.269,P=0.041);而各组的IL-2+CD4+T细胞频数的整体比较则无统计学差异(χ2=0.534)。 结论 HBsAg清除者外周血特异性T细胞应答不是由HBV外膜蛋白诱导的,HBsAg清除可能与HBsAg特异性T细胞免疫不相关,可能是HBV核心抗原诱导为主;血清阴性(anti-HBc阴性)和阳性(anti-HBc阳性)的隐匿性HBV感染者展示出不同的细胞免疫应答特点。隐匿性HBV感染者与HBsAg清除者的特异性T细胞应答特点有异同处,提示两者达到HBsAg阴性的机制可能不同。从慢性HBV感染的自然史的阶段分期结合细胞免疫学应答的特点来分析,我们有理由认为隐匿性HBV感染可能更多的来自急性乙型肝炎恢复者,而HBsAg清除的慢乙肝恢复者可能处于非免疫活动期,也可能处于恢复期,然而,这两种状态都可能因为机体免疫状态的改变或病毒突破而导致HBV感染复燃,重新回到免疫激活期。尤其是HBsAg清除的慢乙肝恢复者,其长期的随访仍然是必需的,而且,从治疗基线起始的临床抗病毒治疗随访,不同时间点进行细胞免疫学的动态分析,可能有助于我们摸索出更合理高效的抗病毒治疗方案,同时也可能获得一些免疫学指标用于临床疗效的预测。通过更敏感的HBsAg检测法联合anti-HBc抗体筛查或核酸检测法(NAT)可以提高隐匿性HBV感染者的检出率,进一步降低输血和器官移植中发生隐匿性HBV感染的机会。


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