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MtDNA SNPs复合检测体系建立及法医学应用研究

何琼  
【摘要】: 生物性检材易受外来环境等因素干扰,一直是困扰法医生物痕迹学专家们的难点问题,如腐败组织、陈旧骨骼等,因检材的降解,使DNA序列的完整性受到破坏,影响鉴定结论的得出。目前国内外法医学实验室应用最为广泛的STR检测系统,通常适用于常规检材,但对微量DNA检材、降解检材、无核检材等则常常因等位基因丢失、非特异性扩增、或扩增不出检测片段,导致检测失败,至今法医生物痕迹学(法医物证)领域尚未完全解决这一难题。 人类线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)是位于细胞核以外的唯一基因组DNA,主要遵循母系遗传,母亲和子女、兄弟姐妹之间的mtDNA在理论上是一致的,个体唯一的mtDNA不存在。mtDNA是由一万六千多个碱基对组成的环状闭合共价双链分子,外有被膜包围,这样的特性使其在外界环境中不易受到核酸外切酶的影响。每个细胞核DNA只有两个拷贝,而每个细胞的mtDNA有成千上万个拷贝,突变率是核DNA的5~10倍,但在外界环境中更易保存下来,扩增时拷贝数更高,对于考古、大型灾难调查、亲缘关系认定、核DNA分型失败的法医学检材等,mtDNA遗传标记具有良好的应用前景。 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)是由基因组水平上的单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性,其中最少的一种在群体中的频率不少于1%,具有在基因组分布广泛、遗传稳定、分析易于自动化等特点。它包括了人类基因组已知多态性的80%,是最常见的遗传变异类型。从生物遗传和变异的本质分析,SNPs将是一种最能反映群体遗传结构和个体间遗传差异的标记系统。由于具有分析片段更小(45-150bp)、遗传稳定,以及可实现高通量、自动化检测等特点,SNPs已经成为法医学解决高度腐败检材DNA分型以及其他领域的研究的热点。在法医学应用SNPs的主要目的是进行大量SNPs位点的同步检测,累计多个SNPs位点的分型结果,认定同一性或亲权关系,从而在个体识别和亲权鉴定中发挥作用。 由于mtDNA具有突变率高、母系遗传、几乎不发生重组、进化速度快等特性,很多研究主要是集中在mtDNA疾病、表观遗传学等方面。目前国内外对线粒体SNPs这一热点领域已经有了很多研究,但大多数针对人类进化、基因突变和表达、药物代谢动力学、表观遗传学、肿瘤学和其他疾病如Parkinson's disease、Alzheimer's disease、肥胖、糖尿病等方面进行研究,进行高通量的研究比较少。虽然也有在法医学应用方面的研究,但还没有针对中国人群已经建立的复合高效检测遗传标记体系的研究。本课题利用复合PCR扩增、荧光标记单碱基延伸(SBE)技术和毛细电泳检测相结合的方法,建立一个多位点的mtDNA SNPs复合检测体系,实现对多个mtDNA SNPs位点同步快速扩增,建立的体系特异性好、灵敏度高、操作简单、准确性高,为微量、降解检材和无核检材的高通量分型提供了新的技术手段和方法,并通过广东地区人群的群体遗传学调查,探讨其在法医学案件中的应用价值。 根据NCBI的dbSNPs数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/dbSnp)、核酸数据库查找到rCRS(修正剑桥参考序列,Revised Cambridge Reference Sequence),从mitoMAP数据库(A human mitochondrial genome database)、mtDB数据库(Human Mitochondrial Genome Database)报道在亚洲人群中多态性较好、侧翼序列稳定的mtDNA SNPs位点和部分从未用于亚洲人群检测位点,其选择目的在于研究在中国人群是否存在多态性,其选择的位点包括8392、5178、8414、10211、14470、13626、15217、709、1719、15607、13928、7028、10398、10400、6392、9090、5843、2092、16519、4833、5250、12438、4529、4580、11719、477、4793、11914、12633、12858、10873、13263、7202。 根据上述位点进行普通PCR引物设计和单个SNPs位点的PCR扩增,利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(nPAGE)和银染技术对单位点PCR扩增产物进行检测验证。其后通过“加尾”设计不同长度的单碱基延伸引物(单碱基引物的长度为18-88nt,每个位点只设计一条引物),利用SNaPshotTM Multiplex Kit试剂盒对每个位点进行单碱基延伸反应及毛细管电泳检测,确定各个位点的迁移距离。通过正交法对复合PCR体系中各组分及PCR反应的循环参数进行调整,去除无法进行复合PCR扩增的位点如2092、6392、9090、5843,引物间二聚体形成的位点如8392,无法用复合单碱基延伸方法检测的位点如10400、8414、5178、10211,有非特异性扩增位点如13626、15217、14470,考虑引物间的相互作用和扩增效率,在保证体系的高多态性的情况下,综合考虑了引物间的相互作用、体系稳定性和扩增检测效率,最终选定了21个mtDNA SNPs位点,建立复合检测体系。 最后使用建立的体系对236名广东地区无关个体、30个三联体家系进行调查,并对实际检案中收集的部分微量、腐败降解检材进行检测分型,评估该体系在法医学中的应用价值;最终获得了21个mtDNASNPs位点的频率分布资料,除位点12438、477外,其余19个遗传标记位点在广东地区人群中均具有遗传多态性。去除12438、477两个位点,最终建立19个mtDNA-SNPs复合检测体系,其基因多样性(gene diversity) GD范围为0.0085-0.4980,共检测到90种单倍型(haplotype),单倍型多样性(haplotype diversity) HD为0.9705。 在建立的10μl PCR复合扩增体系中,最低检测量为50pg,当模板量在0.1~10ng时,能得到较理想结果。检测10种动物血样,猴、牛、猪、鹅、鼠、兔、鸡、羊、狗、猫的DNA样本均无特异性扩增产物。本课题研究中同一个体的肌肉、皮肤、肝脏、脾脏、毛发、指甲、软骨、血痕和骨骼等组织基因分型没有差异性。 本体系采用检测30例家系(外祖母-母-子/女)、20对兄弟和姐妹、5个同一母系来源的表姐妹,未发现有突变,个体分型结果一致。 对实际检案中收集的部分微量、腐败检材进行检测分型,对于50例STR仅检出1-5个基因座的检材,本体系能够成功完成18个mtDNA SNPs以上位点的分型。 结论:本课题研究建立了一个以单碱基延伸和毛细管电泳荧光检测技术为基础的19-plex mtDNA SNPs复合检测体系,包括709、1719、15607、13928、7028、10398、16519、4833、5250、4529、4580、7202、11719、4793、11914、12633、12858、10873、13263。该体系在中国广东地区汉族人群中具有多态性,遗传稳定性好、种属特异性强。所建立的19个mtDNA SNPs复合检测体系灵敏度高、通量大、重复性好、分型准确,特别适合于微量、降解检材和母系亲缘关系等法医学检验。对案件中遇到的毛发、骨骼、肌肉等严重腐败降解及微量检材分型效果满意;且研究平台基于法医DNA实验室常规仪器设备,对腐败降解检材的分型更有效,具有良好的应用前景。


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