改良缺血修饰性白蛋白测定法的建立及评价

【摘要】： 目的： 急性冠脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)是指不稳定的冠脉斑块发生破裂或表面出现糜烂,继发血栓形成,血管痉挛而引起的一系列急性严重的心肌缺血事件,其临床表现为不稳定型心绞痛(unstable angina, UA), ST段抬高型心肌梗死(ST-elevated myocardial infarction, STEMI)和非ST段抬高型心肌梗死(non-ST elevated myocardial infarction, NSTEMI)。其中急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)发病急,死亡率高,如能在AMI早期发现和治疗,能大大提高抢救的成功率,降低AMI的死亡率。对急性胸痛发作的患者进行早期正确的诊断一直是急诊医生特别关注的问题。 缺血修饰性白蛋白(ischemia-modified albumin, IMA)是近年来发现的一种新的生化标志物,是美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)第一个认可的检测心肌缺血的生化标志物,其具有敏感性高、阴性预测值高、出现时间早等特点,它在心肌细胞坏死前的心肌缺血早期就能检测到,在早期诊断AMI具有非常重要的意义。但缺血修饰白蛋白检测方法比较单一,没有统一的标准品,限制了其在临床的广泛应用。本课题拟采用改良缺血修饰性白蛋白测定法并应用于AMI的早期诊断,采用了以1-亚硝基-2-萘酚(1-Nitroso-2-naphthol, NN)代替二硫苏糖醇(Dithiothreitol, DTT)作为显色剂,建立了改良缺血修饰性白蛋白测定法,并进行方法学评价和临床应用评价。为AMI的早期诊断、危险度分层和预后判断提供依据,达到改善病人预后和减少死亡率的目的。 方法： 1、改良IMA测定法的建立 IMA检测是采用白蛋白-钴结合试验,改良ACB试验以NN代替DTT作为显色剂,确定基本反应条件,包括①确定最大吸收波长：从340nm至800nm做波长扫描,测其吸光度,选吸光度波峰点作为最大吸收波长。②确定最佳反应时间：在30min内每隔1min测定一次,每管测定2次,取吸光度均值作反应时间曲线。③钴离子浓度范围的确定：用2.0g/L CoCl2溶液作系列稀释作为试剂1(R1), 0.1g/L NN溶液为试剂2(R2),用722分光度计于最大吸收波长处测定,作吸光度曲线。④NN浓度范围的确定：取R1为0.05g/L CoCl2 3ml,然后依次加入R2为不同量的0.1g/L NN溶液,测定吸光度作系列NN浓度曲线。⑤标本浓度范围的确定：R1:0.05g/L CoCl2,依次加入不同量混合血清反应5分钟再加入R2:0.05g/L NN,以吸光度值作标本浓度曲线。⑥试剂稳定性试验：先批内连续测定混合标本30次,计算出均值和标准差,再将试剂放置于4℃冰箱内,然后每天连续测定同一混合血清标本,再计算其差异,根据以(?)±3s为标准判断是否失效。⑦抗凝剂的影响：采用肝素、3.2%枸橼酸钠和EDTA-K2等抗凝剂,与促凝剂作对比,每种抗凝剂各取10例标本,比较各抗凝剂对本试验的影响。 2、改良IMA测定法的方法学评价 依照美国临床和实验标准化协会(CLSI)评价方案对改良IMA测定法进行方法学评价。①精密度评价：包括批内、批间、天间和总不精密度,主要按照CLSI颁布的EP5-A2文件《定量测量方法的精密度性能评价——批准指南第二版》。实验方法是：选取1个混合血清标本,分装成20份,于-20℃冰箱保存。每天测定2批,每批测定2次,共进行20天。②正确度评价：主要根据CLSI颁布的EP9-A2文件即《用患者标本进行方法学比对及偏倚评估——批准指南第二版》。该方案每天检测8个标本,共进行5天,对在两种方法间检测得到的数据进行统计学处理,分析方法间的偏倚是否可接受。③干扰试验：干扰试验根据CLSI评价方案EP7-A2,即《临床化学干扰试验批准指南——第二版》,采用“配对差异”的实验方法。选择混合血清1份,平均分成2份,一份加入系列浓度的干扰物为临床标本可能出现的最高含量,本实验为甘油三酯、胆红素、血红蛋白,另一份不加。将每份标本重复测定10次,用各组的均值减去未加干扰物相应组的均值即可得出干扰值。以对照该组浓度(?)±1.96s可判断有无干扰；④线性评价：根据CLSI文件EP6-A,即《定量测量方法的线性评价：统计学方法——批准指南》。设5个不同浓度的标本,选择高值和低值标本各一个,高值标本为1号,低值标本为5号,二者3:1混匀为2号,等份混匀为3号,1:3混匀为4号,测定光度值并进行曲线估计；⑤分析灵敏度验证实验：包括空白限(LoB)、检出限(LoD)和定量检出限(LoQ)。根据CLSI颁布的EP17-A文件即《检出限和定量检出限确定方案——批准指南》。⑥钴离子敏感度对比试验：先用2.0g/LCoCl2溶液作15次倍比稀释,分别加入两种显色剂后测定其吸光度,作吸光度曲线比较两种显色剂的灵敏度。 3、改良IMA测定法在早期诊断AMI的应用 随机纳入临床急诊连续就诊的急性胸痛症状患者组成待研究人群,根据WHO诊断标准将研究对象分为AMI确诊患者和AMI疑似患者。绘制IMA在急性胸痛患者中用于诊断AMI的受试者特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC curve),并计算曲线下面积(area under the curve, AUC)。通过ROC曲线以及阳性似然比取最大值的原则确定IMA早期诊断AMI的cut-off值。 结果： 1、改良IMA测定法的建立 取吸光度波峰点作为最大吸收波长,最大吸收波长在410nm左右,波峰值为0.982ABSU。显色最佳时间及稳定性测定整个反应过程在30分钟内稳定性良好。钴离子浓度范围测定值经直线回归相关分析,白蛋白-钴结合线性回归方程为：Y=0.148+0.003X,决定系数R2=0.984,P=0.001。NN浓度范围测定值经直线回归相关分析,白蛋白-钴结合线性回归方程为：Y=0.0004-0.0415X,决定系数R2=0.985,P=0.000。标本浓度范围经直线回归相关分析,白蛋白-钴结合线性回归方程为：Y=1.120-0.001X,决定系数R2=0.990,P=0.000。实验观察到30天内,试剂在4℃性能稳定没有超出范围,试剂性能稳定。分别采用肝素、3.2%枸橼酸钠和EDTA-K2作为抗凝剂,再与促凝剂作对比,评价各种抗凝剂对试验的影响。经方差分析,肝素与促凝剂无显著差异(P0.05),3.2%枸橼酸钠与促凝剂对比有显著差异(P=0.022), EDTA-K2与促凝剂对比差异显著(P=0.001)。 2、改良IMA测定法的方法学评价 ①改良ACB试验精密度评价：批内标准差为0.022、变异系数为2.38%；批间标准差为0.026,变异系数为2.86%,日间标准差为0.012,变异系数为1.36%,室内标准差为0.027,变异系数为2.96%；②正确度评价：两种方法的相关系数是r=0.9890.975,数据通过合适范围检验；回归方程为：Y=1.017X-0.010,R2=0.987,P=0.000,回归标准误为0.035；预期偏倚的上限小于允许偏倚,实验方法正确度性能可以接受。③干扰试验：在加入干扰物TG2.08 mmol/L, Hb5.01 g/L, TBIL68.12μmol/L时无干扰；④线性分析并进行曲线估计得到方程：Y=1.6827-2.171X, R2=0.986, P=0.001,线性良好；⑤分析灵敏度验证实验：LoB=0.321; LoD=LoQ=0.360;⑥钴离子灵敏度对比试验,通过实验观察,用NN作显色剂的敏感度高于DTT, NN作显色剂能检测到0.4883mg/LCoCl2;而DTT作显色剂在CoCl2为7.8125mg/L时才会有明显的吸光度变化,P=0.004。 3、改良IMA测定法在早期诊断AMI的应用 AMI组IMA测定值为1.195±0.320,胸痛组IMA测定值为0.855±0.068,差异显著(P=0.000)。ROC曲线下的面积为0.947,面积下的标准误为0.021,IMA测定值用于诊断AMI有显著意义(P=0.000),IMA测定值越高,AMI的可能性越大,ROC曲线下面积的95%可信区间为(0.905 0.988)。IMAcut-off值为0.906,敏感度为93.0%,特异度82.9%。 结论： 1、建立了以NN为显色剂的改良IMA测定方法,确定改良ACB试验基本反应条件,可应用于全自动生化分析仪及手工测定,适合批量测定及各级医疗单位开展。 2、改良ACB法试验性能稳定,检测速度快,标本可用血清和肝素抗凝血浆。 3、改良ACB试验精密度和准确度好,对钴离子反应灵敏度优于传统ACB法。 4、在临床实际遇到的急诊胸痛症状患者人群中诊断AMI及早期诊断AMI时,改良ACB法测定的IMA具有较高的诊断价值。 本研究的主要创新点： 1、首次以NN代替DTT作为显色剂,建立改良ACB法测定IMA,并进行了方法学评价,改良ACB法能适用于临床IMA的测定。目前国内外未见类似报道。 2、建立了IMA早期诊断AMI的临床cut-off值,并在此基础上确立了IMA早期诊断AMI的敏感度的特异度。