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阿托伐他汀对血管内皮功能及脂多糖刺激的巨噬细胞表达TNF-α的影响

王晓俏  
【摘要】: 研究背景 脓毒症(Sepsis)是感染引起的全身炎症反应征候群,也是危重病人死亡的主要原因之一,临床主要表现为系统性炎性反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome, SIRS)与多器官功能不全(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS)。其病理过程复杂,涉及大量细胞、炎性介质与凝血系统的激活。革兰氏阴性菌(G-)感染是引起脓毒症的重要原因之一,其外膜的活性成分内毒素即脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)与宿主细胞膜上的模式识别受体TLR2和TLR4 (toll-like receptor, TLR)结合,启动一系列信号转导反应,引起多种细胞因子和炎症介质的表达和释放。内毒素可激活补体与凝血系统,促激肽产生,并刺激单核巨噬细胞生成白介素-1(Interleukin-1, IL-1)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)等细胞因子,在脓毒症的病理过程中发挥重要的作用。细菌破裂时,LPS被释放出来,广泛作用于机体多组织器官,其中内皮细胞、单核巨噬细胞和中性粒细胞是最主要的效应细胞。在LPS刺激下,它们产生大量的细胞因子,即“细胞因子风暴”(Cytokin storm),众多实验研究证实前炎症细胞因子TNF-α是脓毒症和脓毒症休克发病的重要介质,巨噬细胞是脓毒症TNF-α产生的主要来源,大量TNF-α的产生可引起多种细胞因子和炎症介质的过度表达和释放,进而引起失控性的炎症级联反应,包括出血、白细胞侵润、血管扩张和血浆蛋白渗出、水肿等,导致微循环障碍、有效循环血量减少,最终引起内毒素休克、组织损伤和多器官功能障碍。因此,临床控制LPS引起的炎症反应成为脓毒症治疗的重要方面,也是该领域重要的研究课题。 动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是一种多因素疾病,多年来曾有多种学说如脂质浸润学说、受体缺失学说、内皮损伤反应学说等从不同角度来阐述其发病机制,根据不同的学说也孕育了动脉粥样硬化性疾病(Atherosclerotic diseases, ASD)不同的治疗方法。目前认为AS各种主要危险因素最终都通过损伤动脉内膜来启动和促进AS, AS也即是动脉对血管内膜损伤作出的炎症纤维增生性反应。越来越多的证据表明,炎症在AS的发生和发展过程中扮演着极为重要的角色,包括炎性细胞的浸润、泡沫细胞的形成、内皮功能的障碍、脂质条纹(斑块)的出现、乃至最终冠状动脉事件的发生等均和炎症密切相关。内皮是血管的重要保护屏障,血管内皮功能障碍作为AS病理过程中的一个早期全身性改变,和巨噬细胞等参与的炎症反应贯穿着AS发生、发展的全部过程,是动脉粥样硬化性疾病发生的核心环节,也是该类疾病防治的主要靶点之一。 心脑血管疾病目前已超越肿瘤性疾病成为人类的第一杀手,而动脉粥样硬化则是心脑血管疾病的最主要原因,虽然目前的治疗方法不断进展,但其发病率和住院率仍呈逐年上升趋势,而脓毒症患者存在动脉粥样硬化基础疾病或的动脉硬化性疾病合并脓毒症的患者在临床上也日益增多。脓毒症的治疗一直是危重病领域的研究重点和热点,而对于动脉粥样硬化性疾病患者出现脓毒症的治疗因为处于危重病和心血管疾病的学科交叉领域因而一直未受到特别的关注。尽管近年来脓毒症的治疗取得了一定的进展,但脓毒症的死亡率仍然居高不下,而动脉硬化性疾病基础上合并脓毒症则进一步增加了其死亡率。因此,如何在现有的治疗条件下探索新的治疗药物和方法以缩短该类患者的住院时间和降低其致残率和死亡率是一个值得深入研究的课题。然而,新药的研发需要漫长的研究过程和巨额的研究费用。因此,近年来,探索现有药物新的治疗用途也日益成为一个研究方向。 他汀类药物即羟甲戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶抑制剂是目前临床广泛使用也是最为重要的调脂药物,是降低血脂并降低心脑血管事件的关键药物之一。目前认为,动脉粥样硬化是一种炎症性疾病,它与脓毒症的发病机制有着很多相似之处。近年来的研究表明,他汀类药物不但具有降脂效应,还具有抗炎、抗氧化、抗栓等功能,后者被认为是他汀类药物的非降脂效应。有许多研究表明,他汀类药物对心脏的保护作用并非主要来自其降脂效应,其抗炎效应在其中扮演着极为重要的作用。因此,他汀类药物作为降脂药物的同时,也被视为抗炎药物的杰出代表,各领域对其研究也逐步深入。脓毒症作为一种炎症反应性疾病,而他汀类药物具有广泛的抗炎症效应,因此,他汀类药物通过调控炎症网络中相关基因表达,减轻炎症反应,从而达到抗脓毒症效应成为一种可能。多伦多一项新的回顾性分析证明,他汀类药物的多效性可能有助于预防心血管疾病患者发生脓毒症。近来有一些小规模临床研究也表明,他汀类药物对脓毒症患者、感染性休克患者预后具有重要保护作用。这进一步提示他汀类药物可能对合并动脉粥样硬化性疾病的脓毒症患者具有很好的治疗效果。但目前尚缺乏这方面的临床和基础研究。 血红素氧合酶-1 (Hemeoxygenase-1, HO-1)是一种血红素降解的催化酶,在蛋白二硫化物还原酶(Protein-disulfide reductase, NADPH)和细胞色素P-450还原酶及分子氧作用下,HO-1催化血红素降解为胆绿素、一氧化碳(Carbon monoxide, CO)和铁,前者还原成胆红素后具有很强的抗氧化能力,后者是一种重要的信使分子。近年研究发现,HO-1及其酶解产物胆红素、CO、转铁蛋白共同发挥着抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡和改善组织微循环等作用,广泛参与心、脑、肺、肝、肾等组织细胞的抗氧化应激损伤,是机体最重要的内源性保护体系之一,尤其是其组织器官的保护作用已逐渐成为目前研究的一个热点。HO-1是一种保护因子,其抗炎、抗凋亡、抗增生作用在内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和其他细胞研究中已得到证实。因此,HO-1通路介导的抗炎症效应也被认为是脓毒症治疗的有效途径。 本课题拟对阿托伐他汀对炎症相关的血管内皮功能障碍的影响及其对脂多糖介导的巨噬细胞炎症反应的干预效应进行研究,并探讨该效应是否由HO-1通路介导,为明确阿托伐他汀在动脉粥样硬化性疾病合并脓毒症治疗中的价值奠定一定的理论基础。 第一章阿托伐他汀对高脂饮食兔血管内皮功能障碍的影响目的:通过高脂饮食建立新西兰兔的高脂血症和血管内皮功能障碍模型,评价炎症在其中的作用和阿托伐他汀的干预效应。方法:16只新西兰兔给予高脂饮食,随机分为单纯高脂饮食组(CTL组,无药物干预)和阿托伐他汀组(ATV组,高脂饮食联合阿托伐他汀),分别测定总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、C-反应蛋白(CRP)、白介素-6 (IL-6)、一氧化氮(NO)、内皮素-1 (ET-1)、无创超声评价的血管内皮功能的基础水平。8周后再次复查上述参数并在ATV组同时撤去阿托伐他汀和高脂饮食,并分别于撤药1、4、7天后再次测定上述参数。结果:8周的高脂饮食可使血脂和炎症标记物(CRP,IL-6)的水平明显升高,导致ET-1/NO的失衡并引起内皮功能障碍。阿托伐他汀治疗能显着抑制该效应,但并不能将其控制到基线水平。阿托伐他汀撤药1、4、7天后未能引起明显的血脂水平变化,但4天和7天后炎症标志物水平明显升高,且内皮功能障碍加重,该效应独立于血脂水平的变化。结论:高脂饮食能引起内皮功能障碍及炎症反应的增强,阿托伐他汀能显著地反向调节该效应。终止阿托伐他汀治疗可导致炎症反应的反弹增强并使内皮功能障碍加重,该效应独立于血脂水平的变化而与炎症密切相关。 第二章阿托伐他汀对脂多糖刺激小鼠巨噬细胞TNF-α表达及分泌的影响 目的:了解阿托伐他汀对LPS刺激的小鼠巨噬细胞TNF-α表达及分泌的影响和可能机制。 方法:小鼠巨噬细胞株复苏后稳定传3代后作为实验用细胞,台盼蓝染色法观察细胞活力,酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunospecific assay, ELISA)测定细胞培养液中TNF-α的水平,定量PCR法检测细胞TNF-α、HO-1的mRNA表达,Westernblot检测HO-1蛋白表达水平。 结果:(1)阿托伐他汀能显著提高RAW 264.7细胞HO-1的mRNA和蛋白表达水平。(2)脂多糖能显著地升高TNF-α的mRNA表达及分泌水平,并呈时间和剂量依赖性,而阿托伐他汀能抑制该效应。但SnPP (HO-1抑制剂)能减弱阿托伐他汀的该抑制效应,而对脂多糖单独刺激的RAW264.7细胞TNF-α水平无明显影响。 结论:阿托伐他汀能减弱脂多糖刺激的小鼠巨噬细胞TNF-α的表达及分泌,该效应可能由HO-1通路介导。


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