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左卡尼汀在肾小管上皮细胞氧化应激损伤中的保护作用研究

叶俊生  
【摘要】: 肾脏缺血再灌注损伤可发生于多种疾病情况下,如休克、外科手术、移植、糖尿病肾病、慢性肾小管-间质损伤等,并伴随着氧化应激的增加。氧化应激由活性氧介导,包括自由基如超氧阴离子、羟基和非自由基如过氧化氢。活性氧在肾组织中的肾小球、间质肾小管、系膜细胞中产生,而组织中的抗氧化防御系统如低分子量抗氧化剂(抗坏血酸素C、谷胱甘肽、维生素E等)、ROS反应酶(超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶)以及氧化还原调节酶等会同时被激活,抑制活性氧生成并降解活性氧。若活性氧的产生量超过机体自身的清除能力,会同时破坏机体抗氧化酶,通过脂质氧化、分解DNA、和蛋白变性等损伤细胞。肾移植过程中移植肾不可避免遭受缺血再灌注损伤,其中主要为氧化应激损伤。肾脏冷保存时组织缺氧,移植恢复血液灌注后即激活瀑布式的炎症反应,产生大量活性氧。移植后活性氧的增加可能还参与了慢性移植肾肾病的发生。活性氧导致的线粒体肿胀,凋亡蛋白酶-3的激活,直接引起细胞坏死或凋亡。在肾脏缺血再灌注损伤后的第一个24小时内,抗凋亡蛋白Bcl-2家族如Bc1-2和Bcl-XL,以及凋亡前蛋白Bax、p53、FADD和Bak在近曲、远曲小管的表达均增加,并且与损伤严重程度相关。抗氧化剂治疗能减轻氧化应激,抑制细胞凋亡和坏死,改善移植物保存效果,减轻相关的损伤和炎症反应。 左卡尼汀(L-carnitine, LC),一种L-赖氨酸的衍生物,是内源性的线粒体膜复合物。人体左卡尼汀的主要生理作用是辅助长链脂肪酸转运到线粒体内部进入β氧化循环,做为一种营养添加剂已应用30余年。左卡尼汀对肾组织的保护作用已经在多种氧化应激模型中得到证实,如:顺铂导致的肾或小肠损伤模型,庆大霉素引起肾毒性模型,肾的缺血再灌注模型以及慢性肾衰模型。左卡尼汀能抑制肾脏缺血再灌注损伤中血清和肾组织MDA的生成。有学者发现左卡尼汀有清除DPPH、超氧阴离子、过氧化氢的能力,提高抗氧化酶的活性,如SOD, CAT和GPx等,并能降低肾组织中的MDA浓度。 根据以上的发现,本研究应用人体近曲小管上皮细胞HK-2作为细胞模型,研究左卡尼汀抗氧化作用的分子机制。作为活性氧的主要成员,过氧化氢在氧化还原过程中产生,被认为是引起细胞内信号传递的信使。过氧化氢能引起脂质过氧化和DNA损伤。因此,我们应用过氧化氢诱导HK-2细胞氧化应激,验证使用左卡尼汀预处理能减轻过氧化氢对HK-2的氧化作用。在此基础上,我们还进一步研究了左卡尼汀在氧化应激中ROS的生成,脂质过氧化、抗氧化系统、线粒体功能和细胞凋亡情况。 第一章左卡尼汀对氧化应激损伤肾小管上皮细胞的保护作用 目的建立过氧化氢诱导的人肾小管上皮细胞系(HK-2)氧化应激损伤模型,探讨左卡尼汀(L-carnitine, LC)对过氧化氢氧化应激损伤人肾小管上皮细胞的保护作用及其可能机制。 方法用不同浓度的H202作用于人肾小管上皮细胞(HK-2),四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力,建立造成肾小管上皮细胞氧化应激损伤模型;实验分为5组:正常细胞组、H202损伤组、单独LC组、LC保护组、N-乙酰半胱氨酸(NAC)组,MTT法检测各组细胞活力,采用酶化学法测定细胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性、以及测定其总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)水平;以氧化敏感的2,7-二氢二氯荧光素(DCFH-DA)染色,荧光显微镜观察及流式细胞仪测定细胞内活性氧(ROS)强度,碘化丙啶(PI)染色流式细胞仪测定HK-2细胞的凋亡率。实验组测量值用均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS16.0统计分析软件对数据进行分析,各组比较应用单因素方差分析(One-Way ANOVA)、组间多重比较应用LSD-t检验,P0.05表示差异有统计学意义。 结果H2O2500μM×30min处理后HK-2细胞活性较正常细胞显著降低(P0.001),单独应用LC 10μM、50μM、100μM处理12小时HK-2细胞活力显著高于正常对照组(P0.001),H202损伤前使用LC预处理12小时能抑制H202损伤所导致的HK-2细胞活力降低(P0.001);H2O2500μM×30min处理后,细胞中SOD,GSH-Px和CAT含量及T-AOC显著低于正常细胞组(P0.001),而LC保护组,细胞中SOD, GSH-Px和CAT含量及T-AOC显著高于H202损伤组(P0.001);H202损伤组MDA、ROS水平高于正常细胞组,细胞凋亡率高于正常细胞组,差别有统计学意义(P0.001),而LC保护组MDA、ROS水平以及细胞凋亡率均显著低于H202损伤组(P0.001)。表明肾小管上皮细胞在经左卡尼汀预处理之后,抗损伤能力加强,损伤程度减少。 结论左卡尼汀对氧化应激所致的肾小管上皮细胞损伤具有保护作用,其作用机制可能与增强细胞抗氧化能力,减少自由基生成,抑制脂质过氧化反应,减少细胞凋亡有关。 第二章线粒体通路在左卡尼汀抑制氧化应激诱导HK-2细胞凋亡中的作用 目的探讨线粒体通路在左卡尼汀(L-carnitine, LC)对过氧化氢氧化应激致人肾小管上皮细胞凋亡中的作用。 方法建立H202诱导的肾小管上皮细胞氧化应激损伤模型;实验分为五组:正常细胞组、H202损伤组、单独LC组、LC保护组、N-乙酰半胱氨酸(NAC)组;Hoechst 33258染色观察细胞凋亡,计算细胞凋亡率;流式细胞仪检测线粒体膜电位和半胱天冬酶3 (caspase-3)的活性;蛋白质印迹法检测凋亡相关活性蛋白Bcl-2和Bax的表达以及细胞色素C的释放。各实验组测量值用均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS16.0统计分析软件对数据进行分析,各组比较应用单因素方差分析(One-Way ANOVA)、组间多重比较应用LSD-t检验,P0.05为差异有统计学意义。 结果Hoechst 33258染色结果显示H2O2损伤组出现典型的细胞致密浓染,核固缩、边缘化等凋亡形态学改变;H2O2损伤组细胞凋亡率显著高于正常对照组(P0.001),不同浓度LC保护组细胞凋亡率显著低于H202损伤组(P0.001),且该效应呈剂量依赖性;使用流式细胞议检测H202损伤组caspase-3活性显著高于正常对照组(P0.001),而LC保护组caspase-3活性显著低于H202损伤组(P0.001);过氧化氢作用可使HK-2细胞线粒体功能紊乱,H202损伤组较正常细胞组线粒体膜电位显著降低(P0.001),Bax/Bcl-2显著升高(P0.001),胞浆细胞色素C显著升高(P0.001);而LC保护组较H2O2损伤组线粒体膜电位显著升高(P0.001),Bax/Bc1-2显著降低(P0.001),胞浆细胞色素C显著降低(P0.001),提示左卡尼汀预处理能剂量依赖性的抑制上述细胞凋亡时的线粒体功能紊乱。 结论左卡尼汀对氧化应激所致的肾小管上皮细胞凋亡具有抑制作用,其作用机制可能与改善线粒体功能有关。


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