收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

表没食子儿茶素没食子酸酯对大鼠脊髓损伤急性期的保护作用及机制

邓凤君  
【摘要】: 目的:建立第8胸椎(T8)半切型脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)大鼠模型,并采用过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)诱导氧化应激损伤的PC12细胞作为神经损伤的细胞模型,从抗氧化、抗炎、抗凋亡等方面探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate, EGCG)对脊髓损伤急性期的保护作用及其可能机制。 方法:从在体和离体两方面来研究EGCG对脊髓损伤的影响。 1在体实验: (1)半切型脊髓损伤模型的建立及分组与给药 成年雌性SD大鼠T8处半切脊髓,造成SCI模型后随机分为6组:假手术组(暴露脊髓,但不进行半切)、模型组(SCI组)、阳性药组(甲基强的松龙,methyllpredriisolone sodiu succinate, MPSS,100mg/kg)、EGCG低剂量组(25mg/kg)、EGCG中剂量组(50 mg/kg)、EGCG高剂量组(100 mg/kg)。动物SCI术后5 min,假手术组和模型组给予生理盐水(10 ml/kg,ip),其余各组ip给予生理盐水配制的药物。 (2)SCI急性期脊髓组织病理组织学及超微结构的观察 SCI大鼠给药24 h后以损伤处为中心取下2 cm脊髓,放入含1 ml多聚甲醛溶液的EP管中避光保存做HE染色的病理切片;以损伤处为中心取下1 cm脊髓,用面刀切成1 mm3的小块置于2.5% 0.5 ml的戊二醛溶液中做透射电镜。 (3)SCI急性期血清炎症因子的检测 SCI大鼠给药24 h后摘右眼球取血5 ml,取血清,采用ELISA法测定血清白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)含量。 (4)SCI急性期抗氧化酶系统与活性氧簇的测定 SCI大鼠给药24 h后取脊髓制备成1%的组织匀浆,根据试剂盒说明书检测脊髓中SOD、MDA、O.2-、NO水平。取脊髓组织制备成凝胶电泳样本,采用Western blot法测定脊髓中iNOS蛋白表达水平。 (5)SCI急性期凋亡有关因子B-细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的检测 SCI大鼠给药24 h后,取脊髓组织制备成凝胶电泳样本,采用Western blot法测定脊髓中Bcl-2和Bax蛋白表达。 (6)SCI急性期内源性神经营养因子营养因子-3(NT-3)和脑源性神经营养因子(BDNF)的测定 SCI大鼠给药24 h后,取脊髓组织制备成凝胶电泳样本,采用Western blot法测定脊髓中内源性神经营养因子NT-3和BDNF蛋白表达。 2离体实验: (1)H2O2诱导的细胞损伤模型的建立 PC12细胞以2×105/cm2接种在50 ml细胞培养瓶,常规培养,培养液每天更换一次,48h内当细胞汇集至80%时进行传代接种。细胞加药处理前采用清饥饿法使之同步化。加入H2O2(终浓度100~600μmol/L)孵育2 h,用噻唑蓝(MTT)法确立PC 12细胞损伤模型。 (2)EGCG对H2O2诱导氧化应激损伤的PC12细胞的保护作用 细胞用EGCG和H2O2处理后,收集细胞培养液,根据乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒说明检测细胞外LDH水平,用以检测细胞膜通透性及完整性;采用MTT法观察细胞线粒体完整性与细胞活力;收集EGCG和H2O2处理后的细胞,用流式细胞术测定细胞周期分布以及细胞增殖率;将细胞接种至内有爬片的6孔培养板,孵育、同步化,用EGCG和H2O2处理后,吸弃上清液,每孔加入10μmol/L BrdU液1 ml,孵育24 h,BrdU免疫荧光法检测细胞周期相S期DNA增生。 (3)EGCG对H2O2诱导氧化应激损伤的PC12细胞保护作用的机制 收集EGCG和H2O2处理后细胞,试剂盒测定细胞内抗氧化酶系统超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的水平。同时根据试剂盒说明书依次测定活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)中超氧自由基(O.2-)、羟自由基(·OH)、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的活性与一氧化氮(NO)含量。采用Western blot检测iNOS蛋白水平,采用real timeRT-PCR测定iNOS-mRNA水平。 结果:从离体和在体两方面结果来研究EGCG对脊髓损伤的影响。 1在体实验: (1)EGCG对脊髓损伤急性期脊髓组织病理组织学及超微结构的影响 HE染色后光学显微镜下观察发现,假手术组大鼠脊髓灰、白质组织结构完整,SCI组脊髓组织切片在损伤区中央灰质可见大片血细胞,并有大量单核或多核的炎性细胞浸润,并可出现囊腔样变化。EGCG低、中剂量组脊髓组织空泡变性减轻,可见血细胞与炎症细胞,以单核或多核炎性细胞为主,但明显低于SCI组。EGCG高剂量组与阳性对照药MPSS组,损伤部位脊髓组织结构排列较完整,偶见炎性水肿,损伤脊髓组织未见明显细胞凋亡,白质内神经纤维排列整齐。 透射电子显微镜观察了脊髓组织神经元和轴突。假手术组脊髓灰质内神经元与白质各索髓鞘规则。SCI组脊髓灰质内神经元胞体固缩,白质髓鞘排列松散。EGCG 25~50 mg/kg组脊髓灰质内能频繁见到胞体肿胀的神经元,髓鞘变薄排列松散。EGCG 100 mg/kg组脊髓灰质内神经元与白质髓鞘结构基本正常。 (2)EGCG对脊髓损伤急性期血清炎症因子的影响 大鼠脊髓半切24 h后,SCI组血清炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、ICAM-1、TNF-α含量增加,与假手术组比较有显著统计学差异(P0.01)。EGCG 25、50、100 mg/kg三个浓度分别作用于SCI大鼠24 h,血清IL-1β、IL-6、ICAM-1、TNF-α含量均减少,与SCI组比较有统计学差异(P0.05),血清IL-8含量亦减少,与SCI组比较,EGCG 25 mg/kg无统计学差异(P0.05),50、100 mg/kg有显著统计学差异(P0.01)。 (3)EGCG抗氧化作用 大鼠脊髓半切24 h后,SCI组脊髓组织SOD水平下降,MDA水平增加,与假手术组比较有显著统计学差异(P0.01)。EGCG 25、50、100 mg/kg三个浓度分别作用于SCI大鼠24 h,脊髓组织SOD水平增加,MDA水平减少,与SCI组比较有统计学差异(P0.05)。 大鼠脊髓半切24 h后,SCI组脊髓组织抑制O.2-活性能力下降,NO水平显著增加,与假手术组比较有显著统计学差异(P0.01)。EGCG 25、50、100 mg/kg三个浓度分别作用于SCI大鼠24 h,脊髓组织抑制O.2-活性能力增加,与SCI组比较有统计学差异(P0.05);EGCG三个浓度亦减少脊髓组织NO水平,与SCI组比较,EGCG 25 mg/kg剂量组无统计学差异(P0.05),EGCG 50、100 mg/kg剂量组有显著统计学差异(P0.01)。Western blot实验结果显示,大鼠脊髓半切24 h后,SCI组脊髓组织iNOS蛋白表达水平增加,与假手术组比较有显著统计学差异(P0.01),EGCG 25、50、100 mg/kg三个浓度分别作用于SCI大鼠24 h,脊髓组织iNOS蛋白表达水平减少,与SCI组比较有显著统计学差异(P0.01)。 (4)EGCG抗凋亡作用 Western blot实验结果显示,大鼠脊髓半切24 h后,SCI组脊髓组织Bcl-2蛋白表达水平下降,Bax蛋白表达水平与Bax/Bcl-2蛋白表达比率增加,与假手术组比较有显著统计学差异(P0.01)。EGCG 25、50、100 mg/kg三个浓度分别作用于SCI大鼠24 h,脊髓组织Bcl-2蛋白表达水平增加,Bax蛋白表达水平与Bax/Bcl-2蛋白表达比率减少,其中,与模型组比较,25 mg/kg组没有统计学差异(P0.05),EGCG 50、100 mg/kg剂量组有统计学差异(P0.05)。 (5)EGCG对脊髓损伤后急性期神经营养因子NT-3和BDNF的影响 Western blot实验结果显示,大鼠脊髓半切24 h后,脊髓组织NT-3、BDNF蛋白表达水平下降,与假手术组比较有显著统计学差异(P0.01)。EGCG 25、50、100 mg/kg三个浓度分别作用于SCI大鼠24 h,脊髓组织NT-3、BDNF蛋白表达水平增加,其中,与模型组比较,25 mg/kg组没有统计学差异(P0.05),EGCG 50、100 mg/kg剂量组有统计学差异(P0.05)。 2离体实验: (1)H2O2诱导的PC12细胞损伤模型 倒置显微镜下观,空白对照组细胞贴壁生长牢固,体积饱满,充分伸展,细胞明亮清晰,折光性好,而损伤组PC12细胞体积明显缩小,突起消失,胞体变小,细胞间隙增大,细胞分布变稀疏的,折光性下降,细胞皱缩,出现不同程度的脱壁,出现明显损伤形态。损伤程度以600μmol/L H2O2最严重的。MTT实验结果显示,与空白对照组相比,100~300μmol/L H2O2剂量能降低细胞活力,但是没有统计学意义,400~600μmol/L剂量能降低细胞活力,且具有显著统计学意义(P0.01)。 (2)EGCG对H2O2诱导氧化应激损伤的PC12细胞的保护作用 LDH水平反映了细胞膜完整性的程度,膜外LDH水平高,则细胞膜受损程度高。500μmol/L H2O2孵育PC12细胞2 h,膜外LDH水平升高,与空白对照组比较有显著统计学差异(P0.01)。EGCG预孵1 h,5、10、20μmol/L剂量组能降低膜外LDH水平,与H2O2组比较有统计学差异(P0.05)。 MTT法测定受损PC12细胞活力与线粒体的完整性,结果显示,EGCG 5-30μmol/L浓度组能显著改善500μmol/L H2O2所致的PC12细胞线粒体的损伤,能显著增加受损细胞的活力,与H2O2组比较有统计学差异(P0.05)。 流式细胞术结果显示,500μmol/L H2O2孵育PC12细胞2 h,G0/G1期细胞分布百分率增加,细胞周期S期细胞分布百分率与细胞增殖率减少,与空白对照组比较有显著统计学差异(P0.01)。EGCG预孵1 h,5、10、20μmol/L三个剂量能降低G0/G1期细胞分布百分率,升高细胞增殖率,与H2O2组比较有统计学差异(P0.05)。EGCG三个剂量组能升高S期细胞分布百分率,与H2O2组比较,5μmol/L组无统计学差异(P0.05),10μmol/L与20μmol/L组有显著统计学差异(P0.01)。 S期DNA合成通过BrdU免疫荧光染色实验来检测。500μmol/L H2O2孵育PC12细胞2 h,BrdU阳性细胞数减少,与空白对照组比较有显著统计学差异(P0.01)。EGCG预处理1 h,5、10、20μmol/L三个剂量组能升高BrdU阳性细胞数,与H2O2组比较有显著统计学差异(P0.01)。 (3)EGCG对H2O2诱导损伤PC12细胞保护作用的机制 细胞经H2O2诱导损伤后,SOD、GSH-Px水平下降,MDA水平上升,与空白对照组比较有统计学差异(P0.05)。EGCG预孵1h,5、10、20μmol/L三个剂量组细胞内SOD、GSH-Px水平上升,MDA水平下降,与H2O2组比较有显著统计学差异(P0.01)。 细胞经H2O2诱导损伤后,细胞内抑制O.2-活性能力下降,产生·OH能力增加,与空白对照组比较有显著统计学差异(P0.01),EGCG预孵1 h,5、10、20μmol/L三个剂量组细胞内抑制O.2-活性能力增加,产生OH能力减少,与H2O2组比较有显著统计学差异(P0.01);细胞经H2O2诱导损伤后,细胞外NO水平与细胞内iNOS活性上升,与空白对照组比较有显著统计学差异(P0.01),EGCG预孵1 h,三个剂量组细胞内iNOS活性与细胞外NO水平下降,与H2O2组比较有显著统计学差异(P0.01);Western blot与real time RT-PCR实验结果显示,细胞经H2O2诱导损伤后,细胞细胞内iNOS蛋白与mRNA表达上升,与空白对照组比较有显著统计学差异(P0.01),EGCG三个剂量组细胞内iNOS蛋白与mRNA表达水平下降,与H2O2组比较,5μmol/L无统计学差异(P0.05),10μmol/L与20μmol/L两剂量组有统计学差异(P0.05)。说明EGCG能有效拮抗H2O2导致的iNOS蛋白与mRNA表达的增加,能抑制iNOS-NO通路的激活。 结论:我们采用T8处半切大鼠脊髓造成SCI体内损伤模型,以及采用H2O2诱导PC12细胞损伤造成神经损伤体外模型,在体与离体给予EGCG干预,通过生化指标及病理的指标观察EGCG对脊髓损伤的作用,主要结论如下: (1)EGCG能保护SCI大鼠受损脊髓,这种保护作用源于:减少SCI大鼠血清炎症因子含量,有显著抗炎作用;提高SCI大鼠脊髓中抗氧化酶系统活性,抑制氧自由基及iNOS-NO通路的激活而发挥抗氧化作用;下调凋亡基因Bax的表达,上调抗凋亡基因Bcl-2的表达而产生抗凋亡作用;同时促进内源性神经营养因子NT-3、BDNF的表达。 (2)EGCG能够维持受损PC12细胞膜完整性,保护细胞的线粒体,延长细胞周期的S期及促进该期DNA合成,增加受损细胞的增殖率。这种神经保护作用源于EGCG提高SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性,降低ROS活性,抑制iNOS-NO通路的激活。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王簃兰;芳香族烃类经皮肤的渗透量[J];国外医学.卫生学分册;1982年01期
2 张寅恭;新杀虫剂Пиримор的卫生毒理学[J];国外医学.卫生学分册;1982年01期
3 蔡海英,张金生,崔小邢,郑国墚,黄孔威;国产维甲酸衍生物对大鼠食管上皮癌变的抑制作用[J];癌症;1983年04期
4 高强;大鼠直肠给心得安以避免首过消除效应[J];国外医学.药学分册;1983年01期
5 Seigo SHUMIYA;Sumi NAGASE;蔡华琬;;大鼠(Rattus Norvegicus)无白蛋白基因(Aualbumia)和盖帽基因(Hooded)的连锁[J];实验动物与比较医学;1983年01期
6 陈国志,黄淑英,王广义,刘志红;豚鼠和大鼠小肠移行性肌电复合波(MMC)的观察[J];基础医学与临床;1984年03期
7 横路谦次郎;不同类型辐射照射复合催乳素诱发大鼠乳腺肿瘤的效果[J];辐射防护;1984年03期
8 温志永;;幼鼠夜间PR 峰的出现对孕酮的依赖作用[J];国外医学.妇产科学分册;1989年05期
9 赵学增;郑富稳;夏烨;;普萘洛尔对雌性大鼠生殖机能的影响[J];河北医科大学学报;1989年03期
10 郑培敏;熊克仁;江家元;;大鼠斜角带核水平支的传入和传出联系——WGA—HRP和HRP法研究[J];皖南医学院学报;1989年04期
11 韦志康,王玉民,伦明跃,徐琳,李云华,邓志诚,吴浩阳;~(241-)镅和~(238-)钚诱发的大鼠骨肉瘤瘤细胞系生物学特性的比较[J];癌变.畸变.突变;1990年01期
12 张玉林,程鸿,秦震;大鼠大脑中动脉阻断导致局灶脑梗塞[J];复旦学报(医学版);1990年03期
13 邹爱平;654-2和多巴胺对大鼠肾脏微循环作用的比较[J];中国病理生理杂志;1991年06期
14 陈启盛,戴义隆,沈上,田苏平;迷走神经与应激性胃粘膜损害的关系[J];南京医科大学学报(自然科学版);1991年02期
15 迟焕方,王守彪,李相民,李良;大鼠中缝核及其邻近网状结构5-羟色胺能神经元的细胞构筑[J];青岛大学医学院学报;1991年04期
16 朱望,周明非,孙向伟,李静,韩洁,王彦;雄激素对大鼠骨骼肌纤维运动终板超微结构的影响[J];神经解剖学杂志;1991年02期
17 王景梓;周序斌;张黎华;吴葆杰;;二十二碳六烯酸抗心血管病作用的研究——Ⅱ.精制鱼油对大鼠血小板聚集功能的影响[J];山东大学学报(医学版);1991年01期
18 张苏;黄威权;王祖禄;蔡晚霞;苏慧慈;;失血性休克对大鼠胰岛生长抑素免疫反应阳性细胞的影响[J];解剖学报;1991年S1期
19 段重高,王莉,李宏伟,成桂仁;三七皂甙对大鼠脑微循环的影响[J];中国病理生理杂志;1992年05期
20 肖殿模,魏晓芳,郑超强,王小鲁,张俊宝,陈华粹,许彩民,潘华珍;为毒素休克大鼠红细胞蛋白激酶C活性的变化[J];中国病理生理杂志;1992年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 程井军;吴其恺;彭锐;孙国杰;;电针对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织氧化及抗氧化状态的影响[A];中华中医药学会第十三届内科肝胆病学术会议论文汇编[C];2008年
2 杨珺超;宋康;鲁建锋;陈君峰;夏永良;;补肺汤对肺纤维化大鼠肺组织中TGF-β1作用的实验研究[A];2009年中华中医药学会内科分会全国中医内科临床科学研究专题研讨会论文汇编[C];2009年
3 廖慧慧;李芳;何燕萍;;罗氏内异方对子宫内膜异位症模型大鼠内膜整合素a vβ 3表达的影响[A];第九次全国中医妇科学术大会论文集[C];2009年
4 王进荣;王平;孟宪丽;杨永茂;张艳;;单向肠灌流法研究芦荟大黄素的大鼠在体肠吸收[A];第十一届全国中药药理学术大会论文摘要[C];2010年
5 史大卓;;接种Walker256肉瘤对急性心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生的影响[A];2010中国医师协会中西医结合医师大会摘要集[C];2010年
6 方杰;胡昔权;郑海清;潘三强;李莉莉;;运动训练对脑梗死大鼠室管膜下区神经新生的影响[A];中国康复医学会第十三届全国脑血管病康复学术会议会议指南[C];2010年
7 孙琳;郭春妮;赵永波;;BM6在Aβ致大鼠海马神经元损害中保护作用的研究[A];2011全国老年痴呆与衰老相关疾病学术会议第三届山东省神经内科医师(学术)论坛论文汇编[C];2011年
8 徐存拴;李三强;周爽;;麻醉对大鼠应激反应的影响[A];中国细胞生物学学会医学细胞生物学、免疫细胞生物学和发育生物学专业委员会学术研讨会论文摘要汇编[C];2002年
9 朱萱萱;王广基;刘建平;王淑云;徐轩;;口腔膜治疗实验性大鼠口腔膜溃疡的研究[A];中国制药工业药理学会20周年学术会议论文集[C];2002年
10 舒清明;张永亮;李灵芝;何冰;李志强;;蛋白质芯片技术检测脑损伤大鼠血清差异蛋白[A];中国生理学会应用生理学专业委员会暨《中国应用生理学杂志》二十周年纪念大会和学术讨论会论文集[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李明波;大鼠掠食行为的神经生物学探讨[D];中南大学;2012年
2 甘贤兵;慢性心力衰竭大鼠心交感传入反射的增强机制研究[D];南京医科大学;2012年
3 杨建新;腹部术后疲劳综合征模型及抗术后疲劳方作用的研究[D];湖北中医学院;2004年
4 杨丹榕;大鼠IgEFcCH2-3受体阻断与IgEFcCH2-3-FasL诱导肥大细胞凋亡的研究[D];第二军医大学;2004年
5 李玉茹;神经营养素及其受体在老年性大鼠耳蜗及下丘中表达规律的研究[D];吉林大学;2005年
6 陈党红;舒筋颗粒对卒中后肌张力增高的影响及可能作用机制探讨[D];广州中医药大学;2005年
7 卢奕;人羊膜细胞在创伤性脑损伤中应用的实验研究[D];苏州大学;2005年
8 潘静薇;NOGO-B在动脉粥样硬化病变中差异表达的研究[D];第二军医大学;2006年
9 王连友;大鼠液压冲击颅脑损伤模型的立体定向控制研究[D];天津医科大学;2006年
10 陈来照;神经肽Y及其受体在垂体腺瘤中的表达及意义[D];天津医科大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 冷婧;限食下活性维生素D对大鼠寿命的影响[D];山西医科大学;2013年
2 孙超;硫化氢对烧伤大鼠肠道组织干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α水平的影响研究[D];青海大学;2013年
3 向芳;围产期大鼠血脂组成与乳腺炎症相关基因的表达变化研究[D];四川农业大学;2011年
4 吴芳庚;环境温度变化致大鼠小肠黏膜免疫屏障损伤的研究[D];南昌大学;2011年
5 郭亚玲;LOX-1和VCAM-1在糖尿病肾病动脉粥样硬化大鼠中的表达及普罗布考的影响[D];蚌埠医学院;2013年
6 张智;培菲康对高脂饮食诱导非酒精性脂肪肝病大鼠肠黏膜屏障的作用[D];广西医科大学;2013年
7 耿立敏;牛磺酸对染锰大鼠丘脑氨基酸类神经递质及其相关酶改变的干预作用[D];广西医科大学;2013年
8 杨科峰;基于BCI的大鼠运动行为控制的研究[D];郑州大学;2011年
9 贾涛;麻醉大鼠肠系膜微循环局部酸环境对微血管反应性的影响[D];山西医科大学;2013年
10 钟丽敏;中枢M受体参与毒血症大鼠星形胶质细胞激活及细胞因子分泌的研究[D];苏州大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 ;关木通对大鼠致癌性的实验研究[N];中国医药报;2003年
2 刘霞;诱导多功能干细胞让小鼠长出大鼠胰腺[N];科技日报;2011年
3 ;丹参能加快放创复合伤大鼠创面愈合[N];中国中医药报;2005年
4 郑健刚;杜元灏;石学敏;针刺能增加脑缺血大鼠脑血流量[N];中国医药报;2005年
5 ;新抗病毒抗生素17997在大鼠体内药代动力学和组织分布研究[N];中国医药报;2003年
6 ;刺五加皂甙对大鼠血管性痴呆有防治作用[N];中国中医药报;2005年
7 ;中药复方能逆转腹主动脉缩窄大鼠心肌肥大[N];中国中医药报;2005年
8 孙忻;人类首次获得克隆大鼠[N];科技日报;2003年
9 记者 许琦敏;大鼠有望成实验室头号“明星”[N];文汇报;2010年
10 记者 姜澎;聪明大鼠 解密大脑记忆功能[N];文汇报;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978