肾间质纤维化中的上皮—间充质转型及Snail1的作用研究

【摘要】：慢性肾脏疾病(Chronic Kidney Disease,CKD)常因起病隐匿,面临着高发病率、高住院率、高死亡率及高额治疗费用等问题,已成为威胁人类健康的隐形杀手,对人类生存质量及社会发展构成极大危害。目前认为,CKD的发展是一种不可逆的过程,最终将形成广泛的肾间质纤维化,并发展为终末期肾衰。而肾间质纤维化(Renal Interstitial Fibrosis)被认为是所有慢性进行性肾脏疾病进展到终末期肾衰的共同组织学特点,在CKD进程中起主导作用。 肾间质纤维化特征性的表现为细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)聚集和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)阳性肌成纤维细胞(Myofibroblast)的大量增殖。而肌成纤维细胞被认为是肾间质纤维化过程中ECM合成和沉积的关键效应细胞,在CKD中起重要作用,但其确切来源目前仍不清楚。1995年,Strutz等首次提出肾间质纤维化过程中存在上皮-间充质转型(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)现象,并认为肾间质纤维化过程中出现的肌成纤维细胞是由肾小管上皮细胞发生EMT产生的,但此观点至今仍无定论。 为此,本课题也试图通过体外诱导人近端肾小管上皮细胞HK-2细胞和体内小鼠的单侧输尿管梗阻(Unilateral Ureteral Obstruction, UUO)模型来研究肾间质纤维化过程中是否存在EMT现象及其分子机制。 在体外细胞模型研究中,本课题首先从形态学上观察了TGF-β1(5ng/ml)、EGF(10ng/ml)单独或TGF-β1(5ng/ml)/EGF(10ng/ml)联合作用对HK-2细胞的影响。结果显示,TGF-β1单独或TGF-β1/EGF联合诱导HK-2细胞后,HK-2细胞在形态上均发生了EMT现象,而且TGF-β1/EGF联合诱导的效果更理想。据此,本研究选择了TGF-β1/EGF联合诱导HK-2细胞作为体外研究肾小管上皮细胞发生EMT现象的模型。细胞划痕实验和细胞迁移实验发现,TGF-β1/EGF联合作用HK-2细胞后,细胞的运动速度和迁移速度均明显增加,提示TGF-β1/EGF联合作用HK-2细胞后,细胞的表型可能发生了EMT转变。进一步采用免疫荧光细胞化学法检测TGF-β1/EGF联合诱导HK-2细胞后,上皮细胞标志CK18、E-cadherin和间质细胞标志Vimentin的表达情况。结果发现,诱导后的HK-2细胞上皮细胞分子标志CK18和E-cadherin均明显下降,而间质细胞分子标志Vimentin的表达则升高,从上皮标志物下调和间充质标志物上调判断TGF-β1/EGF联合诱导HK-2细胞确实发生了EMT。 为了探讨TGF-β1/EGF联合诱导HK-2细胞发生EMT的分子机制,本研究通过RT-PCR和免疫荧光细胞化学法检测了EMT相关的分子。结果发现,转录因子Snail1的转录和表达水平在TGF-β1/EGF联合诱导HK-2细胞发生EMT的过程中明显升高,提示Snail1参与了TGF-β1/EGF诱导HK-2细胞发生EMT的过程。进一步通过免疫印迹研究发现,TGF-β1/EGF诱导后的HK-2细胞中,ERK1(p44)/ERK2(p42)的磷酸化水平很高,提示TGF-β1/EGF联合诱导的HK-2细胞中Snail1的高表达是通过ERK通路调控的,即ERK通路介导调控Snail1的增高,从而导致了TGF-β1/EGF联合诱导HK-2细胞发生明显EMT。 为了进一步证实ERK通路介导了TGF-β1/EGF联合诱导的HK-2细胞中Snail1的高表达,本研究利用ERK通路抑制剂U0126,研究其对TGF-β1/EGF联合诱导后的HK-2细胞中,Snail1转录和表达水平以及细胞形态和运动的影响。结果显示,ERK通路抑制剂U0126抑制了TGF-β1/EGF诱导后HK-2细胞中ERK1/2的磷酸化水平以及Snail1的蛋白表达水平,同时抑制了TGF-β1/EGF诱导的HK-2细胞发生的形态和运动改变,但并未抑制Snail1的转录水平,提示U0126可通过抑制ERK通路中p44/42的磷酸化水平,进而在蛋白水平抑制Snail1的表达量,最终抑制了TGF-β1/EGF诱导的HK-2细胞发生EMT的过程。 在体内小鼠肾间质纤维化模型研究中,本课题首先建立了小鼠的UUO模型,在此基础上本研究着重对小鼠UUO术后14天前的手术侧肾脏进行了组织病理学研究,结果显示,小鼠UUO术后,手术侧肾脏随术后时间的增加,肾间质纤维化的程度越来越严重,提示小鼠UUO模型可用于小鼠肾间质纤维化的研究。进一步通过免疫荧光组织化学和免疫印迹等方法研究了体内肾间质纤维化过程中是否存在EMT及EMT相关分子的变化情况,结果显示,UUO术后肾间质纤维化过程中,上皮细胞标志物E-cadherin的表达降低,肌成纤维细胞的标志物α-SMA增加,同时观察到少量肾小管上皮细胞表达α-SMA,表明小鼠体内肾间质纤维化过程中存在EMT现象。对肾间质纤维化过程中EMT相关分子的检测发现,明胶酶MMP2和MMP9在14天内有增高,提示明胶酶可能参与纤维的降解和平衡,并有助于促进肾小管细胞通过基底膜发生迁移;肾小管上皮细胞中表达PAX2阳性细胞增多,提示成熟的肾小管上皮细胞在肾间质纤维化进程中,逐渐转变为后肾间充质样细胞;研究还发现,在肾间质纤维化的过程中皮质间质内出现了表达BMP7的细胞,其细胞类型和作用有待进一步证实;转录因子Snail1持续上调,提示Snail1在体内肾间质纤维化中具有重要作用。 为了更好的研究转录因子Snail1瞬时高表达对HK-2细胞的表型影响,本研究还构建了人Snail1的重组腺病毒载体,并成功的包装了腺病毒,Snail1重组腺病毒感染HK-2细胞后,形态观察显示,细胞的形态由上皮样转变为成纤维样。通过RT-PCR、免疫印迹和免疫荧光细胞化学的方法证实,Snail1重组腺病毒感染的细胞中,上皮标志E-cadherin的表达减少,与E-cadherin相关的β-catenin从细胞膜转位到细胞质,肌成纤维细胞标志α-SMA上调,明胶酶MMP2和MMP9的转录水平较高。提示所获得的腺病毒可以直接导致HK-2细胞发生EMT现象,这为后续将进行的Snail1对下游分子的调控研究奠定了基础。 总之,本研究通过体内外的手段研究了肾间质纤维化过程中的EMT现象并探讨了Snail1在其中的作用,研究结果得出以下结论:①TGF-β1/EGF联合诱导可导致人肾近端小管上皮细胞HK-2细胞发生明显的EMT现象,其分子机制是TGF-β1/EGF协同作用进一步促进ERK1/2(p44/42)的磷酸化,ERK通路进一步上调Snail1,从而导致肾小管上皮细胞发生明显EMT现象;抑制ERK1/2(p44/42)的磷酸化,可以抑制Snail1的蛋白水平,从而抑制EMT。这具有一定的创新性,进一步丰富了人们对肾小管上皮细胞发生EMT的分子机制的认识。②小鼠体内肾间质纤维化过程中也存在EMT现象,其分子机制涉及明胶酶MMP2和MMP9、PAX2、BMP7和Snail1等多个分子,并首次发现在肾间质纤维化中存在表达BMP7的细胞,其细胞类型和作用有待进一步证实。③Snail1瞬时过表达导致了肾小管上皮细胞HK-2细胞直接发生EMT,这将为人们寻找延缓或阻止肾间质纤维化提供新思路和新靶点。 本研究的创新之处在于:①本研究首次发现,TGF-β1/EGF联合诱导人肾近端小管上皮细胞HK-2细胞发生EMT的分子机制是:TGF-β1/EGF协同作用促进ERK1/2(p44/42)的磷酸化,ERK通路进一步上调Snail1,从而导致肾小管上皮细胞发生明显EMT现象。②在研究小鼠体内肾间质纤维化过程中的EMT现象时,本研究首次发现在肾间质纤维化中存在表达BMP7的细胞,其细胞类型和作用有待进一步证实。