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苦参碱结构修饰物-19抗大鼠实验性肝纤维化作用及机制研究

王绍展  
【摘要】:【研究背景及目的】 肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是指在各种致病因子如炎症、损伤、药物、遗传因素等的作用下,活化的成纤维细胞或肌成纤维细胞(myofibroblasts, MFs)增多,细胞外基质(extracellular matrix, ECM)大量沉积的病理改变。它是继发于各种形式慢性肝损伤之后组织修复过程中的代偿反应,亦是慢性肝病发展为肝硬化必经的病理过程。肝纤维化为一动态过程,属可逆性病变,因此,阻断、抑制或逆转肝纤维化是治疗慢性肝病的一个重要目标。 既往认为,肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是肌成纤维细胞(myofibroblasts)的最主要来源。但是,晚近研究表明原位间质细胞、上皮细胞及内皮细胞,尤其是胆管细胞和肝细胞也被证明可通过上皮细胞间质转型(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)向肌成纤维细胞转化,表明肝实质的上皮细胞也参与肝纤维化进程。 苦参碱是从中国传统中药苦参中提取的一种生物碱,目前的研究发现其抗炎,免疫调节,对小鼠急性肝损伤具有保护作用,并能抗大鼠实验性肝纤维化作用。虽然苦参碱的药理作用广泛,但是活性不高,需要对其进行结构改造,得到活性更强、毒性更低的衍生物。再者,苦参碱的药理作用机制不明确,特别是其靶标蛋白的研究仍是空白。 本课题组前期研究发现,苦参碱的羰基氧原子被硫原子取代后,其药理活性大为增强,为此我们对苦参碱进行结构改造,得到40多个苦参碱衍生物。本研究首先对部分苦参碱衍生物进行抗RAW264.7细胞释放TNF-α作用和抑制NF-кB转录活性的筛选,挑选出药效高,毒性低的苦参碱衍生物-19(M-19);接着对M-19治疗BDL和DMN诱导的大鼠实验性肝纤维化效果进行评价,并初步探讨M-19阻遏EMT进程是其抗肝纤维化的作用机制之一;对M-19抑制TGF-β1诱导原代培养肝细胞、原代培养肝星状细胞和肝星状细胞系HSC-T6细胞EMT进程的阻断,以及对HSC-T6细胞增殖抑制、凋亡诱导作用的研究,阐释M-19抗肝纤维化的多环节机制;通过连续亲和色谱法、竞争亲和色谱法结合MALDI-TOF-TOF质谱鉴定等技术,确证Mat及M-19的特异结合蛋白为核糖体蛋白S5(RPS5)。通过免疫组化和Real-time PCR检测RPS5在纤维化模型大鼠组织中表达变化,以及RPS5在原代肝星状细胞和HSC-T6细胞EMT中的作用研究,推测Mat及M-19可能通过抑制肝脏细胞RPS5的降解或表达水平的下降,而发挥抗肝纤维化作用。 【实验方法】 一、苦参碱衍生物抗RAW264.7细胞释放TNF-α和抑制NF-кB转录活性筛选 (一)采用MTT法测定不同浓度的苦参碱及苦参碱衍生物处理24h,对RAW264.7细胞增殖活性的影响,以比较药物的细胞毒性作用,并确定安全的药理作用浓度范围。 (二)分别采用细胞毒结晶紫法和ELISA法对LPS刺激的RAW264.7细胞上清中的TNF-α生物学活性和含量进行测定,比较苦参碱和一系列苦参碱衍生物对RAW264.7细胞释放TNF-α的抑制作用,筛选出高活性衍生物。 (三)采用双荧光素酶报告基因法,测定苦参碱衍生物对LPS刺激的RAW264.7细胞NF-кB转录活性的抑制作用,进一步比较药物的药理活性。 二、苦参碱及苦参碱衍生物-19抗大鼠实验性肝纤维化作用研究 (一)苦参碱及苦参碱衍生物-19对BDL大鼠肝纤维化的抑制作用 将雄性SD大鼠随机分为7组,假手术组6只,其余各组10只,分设假手术组、胆总管结扎组、苦参碱衍生物-19 :12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg治疗组,苦参碱50mg/kg治疗组,氧化苦参碱50mg/kg治疗组。钝性分离并结扎胆总管,制备BDL肝纤维化模型。术后3d ,各药物组灌胃给予相应药物处理,假手术组和胆总管接扎组灌胃生理盐水。于接扎后第25d处死大鼠,碱水解法测定各组肝组织羟脯氨酸含量;HE染色观察纤维化程度,Masson和Sirius red染色以计算ECM含量。Real time RT-PCR及免疫组织化学法测定肝组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)、钙粘附蛋白(E-cadherin)、HNF4α和TGF-β1等EMT相关基因的表达。 (二)苦参碱及苦参碱衍生物-19对DMN损伤大鼠肝纤维化的抑制作用 将雄性SD大鼠随机分为7组,对照组7只,其余各组每组10只,分设假手术组、胆总管结扎组、苦参碱衍生物-19 :12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg治疗组,苦参碱50mg/kg治疗组,氧化苦参碱50mg/kg治疗组。除空白对照组外,其余各组予1%DMN溶液按照10μg/kg的剂量腹腔注射,每周连续注射3次,共注射5w,制备DMN诱导的大鼠肝纤维化模型。于DMN注射第5w起各组灌胃给予相应药物治疗,空白对照组和模型对照组灌胃生理盐水处理。药物治疗3w后处死,观察指标同BDL模型。 三、M-19体外抗肝纤维化作用机制研究 (一)M-19对原代肝细胞EMT抑制作用研究 分离制备原代培养SD大鼠肝细胞,培养2 d后,换成含有2ng/ml TGF-β1无血清培养基,同时设立空白对照组和M-19: 5 ,10,20 umol/L处理组。刺激48h后,提取细胞总RNA。Real time RT-PCR法检测肝细胞核因子4α(HNF4α)、上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)等基因mRNA水平。 (二)M-19对原代肝星状细胞EMT抑制作用研究 分离制备原代培养SD大鼠肝细胞,培养2 d后,换成含有2ng/ml TGF-β1无血清培养基,同时设立空白对照组和M-19: 5 ,10,20 umol/L处理组。刺激24h后,提取细胞总RNA。Real time RT-PCR法检测α-SMA、Vimentin和Collagen I等基因mRNA水平。 (三)M-19对肝星状细胞系HSC-T6 EMT抑制作用研究 HSC-T6细胞1.5×105/well分于6孔细胞培养板,培养24h后,加入2ng/ml TGF-β1刺激24h,同时设立空白对照组、苦参碱衍生物-19: 2.5,5,,10umol/L处理组。收集细胞,提取总RNA,Real time RT-PCR检测E-cadherin、α-SMA、CollagenI和CollagenIII基因的mRNA水平 (四)M-19对肝星状细胞系HSC-T6增殖抑制作用研究 HSC-T6细胞1.5×10~4/well分于96孔细胞培养板,培养24h后,加入终浓度为0.8 , 4 , 10, 20, 40, 100 umol/L M-19,继续处理24h或48h。MTT法测定细胞的增殖活性 (五)M-19诱导肝星状细胞系HSC-T6凋亡作用研究 HSC-T6细胞1.5×10~4/well分于6孔细胞培养板,培养24h后,加入终浓度为10,20,40 umol/L的M-19,继续处理24h,收集细胞,流式细胞术检测凋亡率 四、MAT和M-19特异结合蛋白的研究 (一)连续亲和色谱法和竞争亲和色谱法分离苦参碱特异结合蛋白 采用苦参碱共价结合树脂,从RAW264.7细胞和Jurkat细胞裂解液中分离苦参碱的特异结合蛋白;采用MALDI-TOF-TOF质谱鉴定特异结合蛋白的多肽序列,数据库分析特异结合蛋白为核糖体蛋白S5(RPS5);再通过RPS5的抗体免疫印迹检测确证。 (二)生物素亲和素系统分离M-19特异结合蛋白RPS5 构建M-19共价结合生物素,与HSC-T6细胞共孵育6h,利用亲和素从细胞裂解液中分离M-19特异结合蛋白;通过RPS5的抗体免疫印迹检测确证 (三)M-19与RPS5共定位分析 构建M-19共价结合生物素(biotin-M-19),与HSC-T6细胞共孵育6h,免疫细胞化学特异性双标biotin-M-19和RPS5,激光共聚焦共定位分析 五、RPS5与肝纤维化关系研究 (一)RPS5在肝纤维化模型中表达水平变化 采用免疫组织化学和Real time RT-PCR技术,检测BDL和DMN致大鼠肝纤维化模型中RPS5蛋白和基因mRNA水平表达变化 (二)RPS5在原代肝星状细胞活化过程中表达水平变化 采用Real time RT-PCR技术,检测原代分离肝细胞在体外培养自发活化过程中,RPS5基因mRNA表达水平变化 (三)TGF-β1刺激下HSC-T6细胞RPS5表达水平变化 采用Western blot检测TGF-β1刺激HSC-T6细胞1,3,5,7d RPS5蛋白表达水平变化情况 (四)RPS5 siRNA对HSC-T6细胞EMT的影响 转染RPS5 siRNA序列si335于HSC-T6细胞,48h后检测E-cadherin和Vimentin蛋白表达情况 【实验结果】 一、苦参碱及其衍生物抗RAW264.7细胞释放TNF-α和抑制NF-кB转录活性研究 30μM的苦参碱衍生物-19,24,对RAW细胞增殖没有抑制作用,且在此浓度时对LPS刺激的RAW264.7细胞释放TNF-α的抑制率分别为70.0%和83.6%(P0.001),效果高于其余药物。30μM的苦参碱衍生物-19,24处理组RAW264.7细胞NF-кB转录活性分别降低为LPS刺激组的48.2% (P=0.002)和52%( P=0.002)。 二、苦参碱及苦参碱衍生物-19抗大鼠实验性肝纤维化作用研究 (一)苦参碱及苦参碱衍生物-19对BDL大鼠肝纤维化的抑制作用 M-19 50mg/kg治疗组与BDL模型组相比:肝组织羟脯氨酸含量(387.74±59.41μg/g) ,较模型对照组(564.18±10~4.27μg/g)显著减少( P =0.0003);肝组织胶原面积减少37% (P0.001);免疫组织化学检测显示TGF-β1、α-SAM和Desmin等蛋白表达显著下调,HNF4α的蛋白表达显著上调;Real-time PCR检测结果表明α-SAM、CollagenIII、TGF-β1等基因mRNA显著下降(P0.05),同时HNF4αmRNA水平显著上调(P0.05)。 (二)苦参碱及苦参碱衍生物-19对DMN大鼠肝纤维化的抑制作用 M-19 50mg/kg治疗组肝组织羟脯氨酸含量(414.97±182.5μg/g) ,较模型对照组(720.3±289.3μg/g)显著减少( P =0.021)。胶原面积较模型组减少64.5%(P =0.023)。免疫组织化学结果表明,M-19 50mg/kg治疗3w,能显著下调TGF-β1、α-SAM和Desmin的表达,同时上调HNF-4α,E-cadherin的表达。Real-time PCR检测结果表明M-19 50mg/kg治疗组与模型组相比α-SMA水平显著下降(P =0.013),而Ecadherin水平显著上升(P =0.004)。 三、M-19体外抗肝纤维化作用机制研究 Real-time PCR检测结果表明:原代肝细胞经M-19 20μM处理48h, HNF4α和Ecadherin的mRNA水平分别为(87.8±3.7%)和(91.41±5.4%),与TGF-β1 2ng/ml诱导组相比(68.3±6.9%, P =0.007 )和(78.9±6.1%, P =0.006)显著升高。 M-19能剂量依赖性的下调TGF-β1 2ng/ml诱导原代肝星状细胞α-SMA(P 0.001)、Vimentin(P =0.021)和CollagenImRNA(P =0.017)水平升高。 对于TGF-β1 2ng/ml刺激的HSC-T6细胞,M19-10umol/L处理组能显著降低α-SMA(P =0.022)和CollagenII(IP0.001)的mRNA水平,同时上调E-cadherin mRNA水平(P =0.007)。 MTT检测结果表明M-19可浓度依赖性的抑制HSC-T6增殖,40umol/L的M-19分别处理HSC-T6细胞24h和48h,对细胞的增殖抑制率分别为79%和94.5%。 流式细胞术检测HSC-T6细胞凋亡率发现,M-19 40umol/L处理24h,能诱导21.14%的HSC-T6细胞凋亡。 四、MAT和M-19特异结合蛋白的研究 采用连续亲和色谱法和竞争色谱法从Jurkat或RAW264.7细胞裂解液中分离出23KD的特异性结合蛋白条带;MALDI-TOF-TOF质谱鉴定特异结合蛋白的多肽序列片段YLPHSAGR ,LTNSMMMHGR,QAVDVSPLR等,与人核糖体蛋白S5(Ribosomal protein S 5,RPS5)匹配,Western blot检测结果确证RPS5为23KD处特异结合蛋白条带。由M-19共价结合生物素分离得到的HSC-T6细胞中特异结合蛋白,经Western blot确证同样为RPS5;免疫细胞化学双标技术检测表明,在HSC-T6细胞内M-19与RPS5特异性结合。 五、RPS5与肝纤维化关系研究 免疫组织化学和Real-time PCR检测结果表明,肝纤维化过程中RPS5表达下调,而M-19治疗组能显著抑制其下调。原代培养肝星状细胞自发活化过程中,RPS5 mRNA水平在第3d就降至64%,之后维持该水平至第7d。免疫印迹检测结果表明,TGF-β1 2ng/ml刺激7天,HSC-T6细胞RPS5的表达逐渐下调。转染RPS5 siRNA 335后,HSC-T6细胞Vimentin蛋白表达上调,同时E-cadherin表达下调。 【结论】 一、M-19和M-24对RAW264.7细胞的增殖活性抑制作用较小,对LPS刺激RAW细胞释放TNF-α抑制作用好于苦参碱及同类苦参碱衍生物,并具有抑制NF-кB转录活性作用。 二、M-19可抑制BDL或DMN肝纤维化大鼠肝组织EMT进程,降低肝脏ECM沉积,具有抗肝纤维化作用。 三、M-19抗肝纤维化作用机制与其抑制肝细胞和肝星状细胞的EMT进程,抑制肝星状细胞增殖,诱导肝星状细胞凋亡有关。 四、核糖体蛋白S5是苦参碱和M-19的特异结合蛋白。 五、核糖体蛋白S5的降低可促进EMT发生,导致肝纤维化。


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