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钙调磷酸酶抑制剂对小鼠Th17细胞分化增殖的影响及其机制探讨

张晓君  
【摘要】:钙调磷酸酶抑制剂对小鼠Thl7细胞分化增殖的影响及其机制探讨 目的 对许多终末期实体脏器疾病来说,器官移植是-个有效治疗手段。但是,尽管目前免疫抑制治疗取得了很大进展,移植排斥反应依然是影响受体长期存活的重要因素之-。th17细胞是2005年新发现的效应CD4_T细胞亚群,产生致炎细胞因子IL-17AF、IL6等,主要介导炎症反应、自身免疫病等的发生发展。文献报道,除th1细胞外,th17细胞也参与了移植排斥反应的进程;当th1细胞反应被抑制时,th17细胞可能发挥了更重要的作用。深入了解影响各亚群细胞分化增殖的因素有利于防治移植排斥反应。而钙调磷酸酶抑制剂作为目前移植临床最常用的免疫抑制剂,其与th17细胞的关系,迄今为止尚未阐明。因此,本课题通过人工建立th17极化环境培育出th17细胞,并建立小鼠颈部心脏移植模型,研究钙调磷酸酶抑制剂对小鼠th17细胞分化增殖的影响并探讨其机制;此外,通过体内实验研究th17细胞相关因子IL-17在小鼠心脏移植排斥反应中的表达及其意义。 方法 小鼠脾脏初始CD4~+CD25 T淋巴细胞使用抗CD3抗体及抗CD28抗体活化,1IGFBl及IL6等细胞因子诱导,促使其向th17细胞方向分化;施加不同剂量的钙调磷酸酶抑制剂如他克莫司或环孢素A进行干予页。使用流式细胞仪检测各组CD4’th17细胞亚群纯度,使用R_r_PCR及WesternBl0t检测各组Il_17mRNA相对量。建立小鼠颈部异位心脏移植模型,实验动物随机分组,分别为同系移植组,异系移植组,CA组及FK506组,观察各组供心存活时间;应用RT.PCR检测移植心脏IL-17mRNA、IFNv mRNA在移植术后2、4、6、8d的动态表达水平;病理切片了解发生排斥反应与否。 结果 本课题通过使用钙调磷酸酶抑制剂(他克莫司与环孢素A),分别在体外环境和体内环境中进行干予页,发现th17细胞的分化增殖受到明显抑制;同时,小鼠心脏的急性排斥反应也得到了有效控制:钙调磷酸酶抑制剂抑制小鼠th17细胞亚群的分化增殖,且呈剂量依赖性。各组问差异有显著性(P0.05)。此外,构建小鼠颈部异位心脏移植的急性排斥反应模型,观察th1、th17细胞因子在急性排斥反应不同阶段的表达情况。研究结果显示,Il,17参与了急性排斥反应的进程。在异系移植组(急性排斥反应组)中,术后第2天即可检测到ILl7 mRNA的表达,其表达量在术后第4d达丑高峰,随后逐渐下降,在术后第6d无表达。而th1细胞的主要细胞因子IFNv mRNA的表达则晚于IL-17 mRNA。这从侧面说明th17细胞和th1细胞在急性排斥反应的不同阶段分别发挥着重要作用。 结论 th17细胞在移植排斥反应的进程中起着重要作用,对IL-17的检测可以作为急性排斥反应早期诊断的予页见性指标。而钙调磷酸酶抑制剂除了可以抑制th1细胞外,对th17细胞的分化增殖和IL-17的释放也有着强大的抑制作用。以上研究发现,均有利于我们进-步了解移植排斥反应的进程和指导临床防治。本课题探讨了钙调磷酸酶抑制剂对小鼠th17细胞的影响:通过体外实验及体内实验发现,在钙调磷酸酶抑制剂存在的环境下,th17细胞亚群分化增殖明显减少;IL-17mRNA表达降低,且呈齐【量依赖性。这种现象需要新的机理进-步解释。经广泛阅读文献发现:Gomez—R0drigucz等在对T细胞受体信号通路及ITK蛋白的研究中提出:th17细胞内il基因的表达除了受RORm和S1_AT3转导的细胞因子刺激外,还要接受TCR信号通路钙调磷酸酶介导信号的刺激。th17细胞细胞因子IL-17A的表达与Ca2+内流和NFAR激活有关;反之,1ICR信号通路刺激减少或钙调磷酸酶受抑制优先减少了IL-17A的表达。由此推理得出结论,钙调磷酸酶抑制剂抑制th17细胞胞浆内的钙调磷酸酶,从而阻止NFA_rc的脱磷酸化和核内转移过程,进-步抑制il基因的转录活性,抑制Il,17A产生并减轻炎症进程,从另-途径抑制了排斥反应。钙调磷酸酶抑制剂可以抑制th17细胞亚群的分化增殖。本课题进-步阐明了钙调磷酸酶抑制剂发挥免疫抑制作用的机制,为临床上科学应用钙调磷酸酶抑制剂提供实验依据和理论基础。


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