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MiR-34a在大鼠肝脏再生终止阶段的作用及机制研究

董瑞琦  
【摘要】:人和动物的肝脏具有很强的再生能力。大鼠的肝脏在70%切除(PHx)后,可启动再生反应,在7-10天内基本恢复原有的体积和体质量,这个过程叫做肝再生。肝再生的过程可以分为三个时期:启动期、再生期和终止期。肝再生过程受到很多种复杂因素的精密调控,包括各种生长因子、细胞因子和激素等。肝脏再生与肝癌都表现为肝细胞极强的增殖能力,但两者有明显区别:肝癌具有无限细胞分裂和增殖能力,缺乏终止机制,而肝再生具有自动终止机制。长期以来,肝再生研究主要集中在肝脏再生启动和增殖阶段相关正调信号,而对肝脏再生终止、肝脏组织重塑和肝脏大小精确调控等负调信号及其分子机制的研究和认识很少。因此,研究肝再生的负调机制,找出各种调控分子的变化规律和相应的分子机制,不仅有助于对肝再生的进一步认识,对肝癌病理机制的认识和治疗靶点的探索等也具有积极意义。 microRNA (miRNA,miR)是长度为22-25nt的单链短序列非编码RNA ,它可以与靶mRNA的3’非编码区的特定部位结合使得翻译抑制或mRNA降解,属于转录后负性调控。它参与了动植物发育、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡和肿瘤发生等重要生理和病理过程。研究证明miRNAs通过下调不同癌基因或抑癌基因,而发挥抑癌基因或癌基因的作用。因此,有理由认为这些对细胞增殖具有正调或负调作用的miRNAs可能是肝再生复杂调控网络中的重要部分。但至今有关miRNAs与肝脏再生研究还很少,几个研究只限于肝脏再生启动和增殖阶段,还没肝再生终止相关的miRNAs研究报道。 为此,本课题采用miRNAs芯片筛选大鼠肝再生后期(PHx后5d)miRNAs差异表达谱,并对显著表达差异miRNAs检索targetscan数据库和MAS软件分析获得受此miRNAs调节的相应靶基因;进一步利用大鼠肝脏再生模型和肝细胞系,以及荧光素酶报告基因分析和基因干预技术等来探讨miRNA在肝再生终止中作用及可能机制。 结果 1. miRNAs芯片筛选和验证 大鼠肝再生后期(PHx后5d)miRNAs差异表达miRNAs共10条(下调2条,上调8条),其中表达差异达2倍以上的只有miR-34a,其上调幅度达5.6倍。在肿瘤研究中证实miR-34a是肿瘤抑制因子,它通过负调细胞周期蛋白、凋亡抑制因子和细胞增殖信号分子导致细胞周期终止、细胞凋亡和衰老。我们通过检索targetscan数据库和MAS软件分析,获得mir-34a的靶基因,这些靶基因与细胞周期、细胞凋亡,以及与TGF-β和HGF/c-Met通路相关的靶基因miR-34a。这初步表明mir-34a可能与肝脏再生终止密切相关。我们首先选择了INHBB (Inhibin B,主要拮抗同族的Activin A和BMP,削弱TGF-β通路信号[23])和c-Met(HGF受体,HGF/c-Met通路在肝脏再生中具有重要作用)两个靶基因,在大鼠肝再生模型和细胞水平上进一步验证了INHBB和c-Met与miR-34a关系。 2. miR-34a、INHBB和c-Met在大鼠肝脏再生中的表达 miR-34a在大鼠肝脏再生全程的表达规律:PHx后3d时miR-34a显著上调,5d时表达最高,是对照组的6倍以上,9d时基本恢复到正常水平。PHx后5d时INHBB和c-Met的mRNA水平和蛋白质水平均显著下降,呈现与miR-34a反相表达。该结果提示INHBB和c-Met在肝再生过程中可能受miR-34a调节。 3. miR-34a对肝细胞系(BRL-3A)生物学功能及靶基因的影响 用miR-34a的mimics转染大鼠肝细胞BRL-3A后,用MTT法来检测miR-34a对大鼠肝脏细胞增殖调控的影响,在4天时可观察到miR-34a对BRL-3A细胞的增殖抑制作用,6天时抑制作用达到最高水平。实验结果证明了miR-34a可以抑制大鼠正常肝细胞增殖。随后,用miR-34a的mimics转染大鼠肝细胞BRL-3A后48h,流式细胞术检测细胞凋亡和周期的变化情况,发现处理后细胞滞留在G2期,miR-34a组G2期细胞比例为(23.14±4.26)% ,对照组(NC)为(8.48±2.93)%,同时出现明显的凋亡峰。这表明miR-34a有明显负调肝细胞功能。用miR-34a mimics转染大鼠正常肝细胞BRL-3A,检测miR-34a对靶基因的调控。结果证明, miR-34a可以负调MET和INHBB的水平。 4. miR-34a负调INHBB表达 虽然c-Met在HeLa细胞和HepG2细胞中已证实为miR-34a的靶基因(He et al. 2007; Li et al. 2009)。而miR-34a是否直接调节INHBB还没有实验验证,所以我们首先选择INHBB作萤光素酶报告基因分析,将INHBB基因的3'-UTR(INHBB-UTR)和突变3'-UTR(INHBB-Mu-UTR)分别并与萤光素酶报告基因重组,并与miR-34a的mimics共转BRL-3A细胞。结果发现miR-34a抑制融合了INHBB-UTR的萤光素酶基因表达,而融合INHBB-Mu-UTR的萤光素酶基因表达不受影响,这表明miR-34a可直接下调INHBB。 5.在体动物下调miR-34a的初步研究 利用慢病毒在体干预miR-34a基因表达,进一步在动物水平上探讨miR-34a在肝再生终止中的作用。结果显示下调miR-34a的动物肝再生度有较显著高于对照组。这表明下调miR-34a后可能影响肝再生的终止进程。 结论 miR-34a与大鼠肝再生终止密切相关;miR-34a通过负调INHBB和c-Met等促进肝再生终止。


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