晚期糖基化终末产物受体及其配体HMGB1在大鼠重症急性胰腺炎发病中的作用研究

【摘要】：急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是临床的危重急症,大多数患者是轻症胰腺炎,且为自限性,通常在发病数日后可好转；但仍有约20%-30%的患者表现为重症急性胰腺炎。重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)以全身炎症反应综合症、多器官功能衰竭及胰腺局部并发症为特征,尽管临床治疗方法不断改善,但目前病死率仍高达15-30%。早期阶段的多器官功能衰竭及后期感染等并发症是导致重症急性胰腺炎高死亡率的主要原因。多器官功能衰竭是全身性炎症反应的结果,值得注意的是过度激活的巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞释放的炎症因子可能导致远处器官的损伤。在重症急性胰腺炎的发病过程中,胰腺局部、以及全身性炎症反应发挥了重要作用。深入认识和研究重症急性胰腺炎的炎症反应机制,对于其治疗方法的探索一直是研究的热点。 SAP的一个重要问题是尚没有一个特异的血清学或者其他指标来诊断和预测预后,进而指导治疗。目前临床上已有通过检测血清淀粉酶和C-反应蛋白等判断SAP预后,但是应用价值非常有限。 晚期糖基化终末产物受体(the receptor for advanced glycation end products, RAGE),属于细胞表面分子免疫球蛋白超家族多配体受体成员,广泛分布在单核-巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、肾小球系膜细胞、肿瘤细胞、星形胶质细胞、T淋巴细胞等细胞表面；晚期糖基化终末产物受体是介导HMGB1细胞因子活性的重要受体。除HMGB 1,其配体还包括糖基化终末产物、p淀粉样肽、S100蛋白等。RAGE与其配体相互作用常导致快速持续的细胞活化和下游基因转录,多种细胞信号ERK1/2(p44/p42)、p38和SAPK/JNK MAP激酶,rho-GTP酶类,磷酸肌醇-3-激酶和JAK/STAT信号途径在不同类型细胞中被激活,并通过核因子kappaB (Nuclear Factor-kappaB, NF-kB)持久活化维持和扩大炎症反应。有报道指出,RAGE敲除小鼠能耐受盲肠结扎穿孔引起的感染性休克,表明RAGE在系统性急性炎症过程中发挥重要作用。 RAGE属于单跨膜片段受体,分为胞外段、疏水的跨膜区和胞内段3部分；其胞外部分包含了一个“V”型区和两个“C”型区,与HMGB1结合的主要部位位于N端的“V”型区。最近,在人类和小鼠肺内发现几种RAGE的变异体,公认的有可溶性RAGE(soluble RAGE, sRAGE)和内源性分泌型RAGE(endogenous secretory RAGE, esRAGE)。虽然它们的产生机制及分子大小不尽相同,但由于都包括配体结合的细胞外区域而缺乏跨膜区域,因此能与RAGE竞争同RAGE配体的结合,并阻断RAGE信号向细胞内转导。可溶性RAGE(sRAGE)存在于循环中,由RAGE的胞外段构成；sRAGE包括esRAGE和RAGE蛋白水解裂解的形式。在晚期肾脏疾病和急性肺损伤由sRAGE水平升高。在类风湿性关节炎、阿尔茨海默病、老年性痴呆和原发性高血压中sRAGE水平降低。目前,有研究提示重症急性胰腺炎是否合并器官衰竭时,sRAGE水平显著不同。 高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1, HMGB1)是RAGE的主要配体之一,是一种DNA结合蛋白,又称两性蛋白,因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳时的快速迁移而得名,是迄今为止所发现的唯一的能在细胞外诱导细胞因子和活化炎症细胞的核内蛋白。HMGB1具有3个结构域,即A、B、C区,A和B区主要构成HMGB1的非特异性DNA结合区；C区可与其它蛋白相互作用来调节HMGB1与DNA的亲和力。HMGB1分布十分广泛,在多种器官组织(如淋巴组织、脑、肝、肺、心、脾、肾等)的细胞中均有表达,它通过两种不同的途径释放至细胞外：活化炎症细胞的主动分泌和坏死细胞的被动释放。最近的研究表明细胞外的HMGB1可作为一种晚期炎症因子参与脓毒症的病理生理,并且在重症急性胰腺炎(severe acute pancreatits, SAP)从全身炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)到多器官功能不全(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)、多器官功能衰竭(multiple organ failure, MOF)的过程中起到非常重要的作用。而且与其它促炎因子如肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis factor-alpha, TNF-a)和白介素-1(interleukin-1, IL-1)不同,HMGB1具有出现晚,但持续时间长的特点,从而扩大了临床治疗的时间窗。 目前国内外关于重症急性胰腺炎与RAGE及其配体HMGB1的研究较少,为明确RAGE在重症急性胰腺炎发病中的作用,我们拟建立大鼠重症急性胰腺炎模型,观察重症急性胰腺炎造模成功后大鼠胰腺组织内RAGE及其配体HMGB1在转录及蛋白水平的变化,同时通过ELISA法检测血清中sRAGE和HMGB1这两种炎症因子水平。这一研究不仅为临床治疗重症急性胰腺炎提供新的思路,而且也对其他有炎症机制参与的急性损伤性疾病提供借鉴和参考。 一、大鼠重症急性胰腺炎模型的建立 目的：制备SAP动物模型,了解大鼠SAP病程规律,为下一步实验研究提供基础。 方法：将64只雄性SD大鼠随机分为8组,用生理盐水配置20%L-精氨酸溶液,利用腹腔注射的方法,按照250mg/100g的剂量,间隔一小时重复注射一次,制备SAP模型,对照组SD大鼠腹腔注射等量生理盐水。造模后6h,18h,24h,36h,48h,72h,96h分批处死大鼠,心脏采血,室温静置后离心分离血清,分装后放置于-80℃冰箱低温保存。同时留取胰腺、肝脏、肺脏、肠道组织。测定血清淀粉酶(serum amylase, AMY),染色观察胰腺组织、肺脏病理学变化并评分。 结果：造模后6h起,血清淀粉酶水平就开始升高,其中SAP18h组血清淀粉酶水平显著高于其他各组。大鼠SAP模型各时间点腹水量随着病情进展逐渐增多,至SAP 96h组腹水量达到最高水平。光镜下,对照组胰腺组织结构清晰,腺泡结构完整,小叶间隔清晰,有轻度水肿,无炎细胞浸润及出血、坏死。大鼠造模后6h起,胰腺病理评分显著升高,SAP 6h组胰腺组织出现间质水肿,有轻、中度的炎细胞浸润,以中性粒为主,腺泡结构尚好,组织结构无明显破坏。SAP18h组胰腺间质显著水肿,有大量炎细胞浸润,有轻度的实质坏死和出血。SAP 24h组胰腺腺泡细胞肿胀,可见灶性坏死,腺泡细胞间有大量炎症细胞浸润,胰腺实质内红细胞渗出较多,胰腺坏死、出血较18h明显。SAP 36h组腺泡结构破坏较多,小叶排列紊乱,其间充斥大量炎性渗出,坏死区内腺泡结构消失。SAP 48h组腺泡结构严重破坏,胰腺组织大片破坏,周围脂肪组织明显充血,大量炎症细胞浸润。SAP 72h组坏死加重,腺泡结构消失,坏死区HE染色为粉红色无结构区域,胞核溶解,叶间隙增宽,间质微血管破裂,大量红细胞溢出,片状脂肪坏死形成,可见皂化斑。SAP 96h组胰腺组织坏死达到最高程度。光镜下,对照组大鼠肺泡壁完整,肺间质无炎细胞浸润,肺组织结构清晰。SAP24h组肺脏间质增宽,肺泡腔内出现淡红色渗液,伴有肺泡萎缩,肺泡及间质有大量中性粒细胞浸润。SAP 36h组肺泡间质明显增宽,肺泡腔内显著充血、水肿,有大量炎细胞浸润。SAP 48h、SAP 72h、SAP 96h组肺泡结构紊乱,肺泡壁破裂,肺泡腔出血明显,肺泡间隔显著增宽,大部分肺泡和间质中有中性粒细胞浸润,结构损害严重。 结论：腹腔注射20%L-精氨酸溶液制备大鼠重症急性胰腺炎模型,具有操作简便,快捷,对动物创伤性小,可重复性好,模型稳定,成功率高等优点,是一种较理想的模型,为进一步开展SAP致病机制相关研究奠定基础。 二、RAGE在大鼠重症急性胰腺炎中的表达 目的：研究大鼠SAP发病过程中胰腺组织中RAGE及血清中sRAGE含量变化的规律。 方法：按照各时间点处死大鼠,无菌条件下留取胰腺组织,抽提总mRNA,经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出大鼠RAGE,扩增产物与预期目的基因一致。用实时定量PCR (real-time PCR)的方法检测胰腺组织RAGE mRNA表达；免疫组化法(Immunohistochemisty, IHC)检测SAP不同时段组大鼠胰腺组织中RAGE蛋白表达；采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent adsorption method, ELISA)检测血清中sRAGE水平。 结果：实时定量PCR方法检测RAGE在mRNA水平的表达,统计结果显示SAP 6h组、SAP 18h组、SAP 24h组、SAP36h组、SAP 48h组、SAP 72h组及SAP 96h组RAGE在胰腺组织中的相对表达量显著高于对照组(P0.05),其中SAP 24h组及SAP 36h组RAGE在胰腺组织中的相对表达量显著高于其他时相组(P0.05),之后有降低趋势。IHC从蛋白水平显示SAP 48h组胰腺组织炎症细胞胞膜及胞浆中有RAGE的表达,对照组无表达。本实验还通过RAGE ELISA试剂盒测定血清中sRAGE含量,结果显示对照组血清中sRAGE浓度较低,SAP 6h组sRAGE浓度开始升高,与对照组比较有明显差异(P0.05)；SAP18h组sRAGE浓度明显升高,SAP 24h组sRAGE浓度达峰值,与其他各组相比有显著差异(P0.05)；24h后,血清中sRAGE浓度开始下降,但SAP 36h组及SAP 48h组sRAGE浓度仍维持在相对较高的水平,SAP 96h组sRAGE浓度下降至接近基线水平,与对照组相比差异仍具有统计学意义(P0.05)。 结论：RAGE在重症急性胰腺炎的发生发展过程中有重要作用,组织和血清中的RAGE表达呈时间依赖性,血清中RAGE的表达可部分反映SAP的病程。 三、HMGB1在大鼠重症急性胰腺炎中的表达 目的：研究大鼠SAP发病过程中胰腺组织及血清中RAGE配体HMGB1蛋白的变化规律 方法：按照各时间点处死大鼠,无菌条件下留取胰腺组织,抽提总mRNA,经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出大鼠HMGB1,扩增产物与预期目的基因一致。用real-time PCR的方法检测胰腺组织HMGB1 mRNA表达；IHC检测SAP不同时段组大鼠胰腺组织中HMGB1蛋白表达；采用ELISA检测血清中HMGB1水平。 结果：实时定量PCR方法检测HMGB1在mRNA水平的表达,统计结果显示SAP 6h组、SAP18h组、SAP 24h组、SAP 36h组、SAP 48h组、SAP 72h组及SAP 96h组HMGB1在胰腺组织中的相对表达量显著高于对照组(P0.05,),其中SAP 36h组HMGB1在胰腺组织中的相对表达量显著高于其他组(P0.05)。IHC从蛋白水平显示SAP 36h组大鼠胰腺腺泡细胞及炎症细胞胞浆、胞核及胰腺间质中有HMGB1蛋白表达,对照组无表达。本实验还通过HMGB1 ELISA试剂盒测定血清中HMGB1含量,结果显示对照组血清中HMGB1浓度较低,SAP 6h组HMGB1浓度开始升高,与对照组比较有明显差异(P0.05)；SAP18h组及SAP 24h组HMGB1浓度明显升高,SAP36h组HMGB1浓度达峰值,与其他各组相比有显著差异(P0.05)；36h后,血清中HMGB1浓度开始下降,但SAP 48h组及SAP 72h组HMGB1浓度仍维持在相对较高的水平,SAP 96h组HMGB1浓度下降至接近基线水平,与对照组相比差异仍具有统计学意义(P0.05)。 结论：HMGB1可能作为晚期炎症因子参与了重症急性胰腺炎的全身炎症反应,且其在血清中出现的时相晚于其受体RAGE。 通过上述研究,本课题得出以下结论： 1、通过腹腔注射L-精氨酸成功建立重症急性胰腺炎大鼠模型。 2、RAGE在重症急性胰腺炎的发生发展过程中有重要作用,组织和血清中的RAGE表达呈时间依赖性,血清中RAGE的表达可部分反映SAP的病程。 3、HMGB1可能作为晚期炎症因子参与了重症急性胰腺炎的全身炎症反应,且其在血清中出现的时相晚于其受体RAGE,二者有望作为SAP的诊断标志物。