自噬在脂肪酸诱导肝损伤中的作用及机制的初步研究

【摘要】：研究背景 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指一种无过量饮酒史,以肝实质细胞脂肪变性和脂肪蓄积为特征的临床病理综合征,包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、脂肪性肝纤维化和肝硬化。有研究表明,约有90%的健康体检人群肝酶学指标异常的常见原因是非酒精性脂肪肝。而约有20%患非酒精性脂肪性肝炎的病人会最终发展为肝硬化。非酒精性脂肪肝是一种重要的代谢性疾病,有数据表明大概18%的正常体型和27%的肥胖人群会患有这个疾病,严重威胁着人类的健康安全。目前存在多种关于非酒精性脂肪肝发病机理的学说,但具体机制仍不清楚,因此,非常有必要对NAFLD的发生、发展及其发病机制进行深入研究。 自噬是生物体内一种相对保守的对物质进行分解代谢的过程,它通过“自我清除”细胞内无用的、累积的蛋白质聚集物和有缺陷的细胞器等,维持细胞内环境的稳态。在受到饥饿、高温、低氧等外界环境刺激下,细胞通过提高自噬水平,将胞浆内多余组分分解为游离氨基酸、脂肪酸和核苷酸,维持细胞的能量代谢。自噬主要分为三种类型:巨型自体吞噬(macroautophagy) ,微型自体吞噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自体吞噬(chaperonmediated autophagy)。目前发现至少有三十余种基因参与酵母autophagy过程,这些基因被统一命名为酵母自噬相关基因ATG (AuTophaGy-related)。其中许多酵母中autophagy相关基因均已在哺乳动物中找到同源物,并以分离鉴定成功,表明autophagy是一种进化保守的过程。在哺乳动物的自噬泡形成过程中,由Atg3, Atg5, Atg7, Atg10, Atg12和LC3 (Microtubule-associated protein 1 light chain 3, MAP1-LC3)参与组成的两条泛素样蛋白加工修饰过程:Atg16与Atg12-Atg5结合过程与前自噬泡(Preautophagosome)的形成相关,而LC3修饰过程对自噬泡(Autophagosome)的形成必不可少。自噬在生物体生长发育、细胞分化及对环境应激的应答方面极为关键,对防止某些疾病如肿瘤、肌病、神经退行性疾病以及对抵御病原微生物的感染和延缓衰老、延长寿命等方面发挥重要作用。 近期,有大型流行病学调查结果显示肥胖,尤其是体重指数25的人群,会显著增加罹患癌症的几率。其中高BMI这个高危因素易引发肝细胞癌。Michael Karin研究小组发现,给DEN诱导肝癌模型的小鼠分别喂养普通饮食和高脂饮食后,高脂饮食组小鼠肝癌的发生率明显增加。然而自噬是否参与调控NAFLD的发生发展过程目前尚未见系统报道。本课题首先从动物水平和细胞水平研究了高脂饮食和游离饱和脂肪酸诱导的肝细胞损伤对自噬的影响,进一步通过分子生物学技术初步研究了自噬在脂肪酸诱导的肝细胞损伤过程中的作用,并探讨了其发挥作用的可能机制。本研究旨在为深入认识NAFLD发病机制,进而寻找其相应的治疗靶点提供一定的实验依据。 实验方法: 1.用高脂饮食喂养小鼠,建立NAFLD小鼠模型,Western blot方法检测高脂饮食小鼠肝组织中自噬泡标志分子LC3-Ⅱ的蛋白水平; 2.应用Western blot技术检测脂肪酸刺激对肝细胞系自噬泡标志分子LC3-Ⅱ的蛋白表达的影响; 3. GFP-LC3表达质粒瞬时转染肝细胞系,荧光显微镜下观察脂肪酸刺激下肝细胞中自噬泡的形成; 4.电子透射显微镜观察高脂饮食小鼠肝组织和游离脂肪酸处理细胞中自噬泡的形成; 5. Real-time PCR技术检测正常饮食小鼠与高脂饮食小鼠肝组织中自噬相关基因的mRNA表达水平差异;同时在细胞水平检测对照组和游离脂肪酸处理组细胞中自噬相关基因mRNA表达水平差异; 6.通过自噬抑制剂实验观察自噬在PA诱导的肝细胞损伤过程中的作用; 7.细胞水平提供通路抑制剂实验明确PA诱导的自噬所依赖的具体通路; 8.进一步使用siRNA干扰技术明确PA调节自噬的具体通路; 9.通过自噬相关基因siRNA干扰实验,初步探讨自噬在PA诱导肝损伤中的作用。 实验结果: 1.高脂饮食小鼠肝组织中自噬通路高度激活,自噬标志性分子LC3-II水平明显升高; 2. PA刺激状态下肝细胞系SMMC-7721、HepG2、LM3及L02自噬活化明显升高; 3.在游离脂肪酸诱导肝损伤的过程中,自噬相关基因Beclin1、atg5和atg7在动物水平和细胞水平均无明显改变; 4.高脂饮食小鼠肝细胞内JNK通路明显活化;JNK抑制剂可有效抑制PA诱导的自噬,并且JNK2在其中可能起主要作用,抑制JNK1能有效阻止细胞的凋亡; 5.干扰Beclin1和Atg5的表达可以抑制脂肪酸诱导肝损伤过程中自噬标志LC3-II的表达。 实验结论: 在高脂饮食小鼠肝组织中和游离脂肪酸诱导细胞损伤中肝细胞自噬活性明显升高,JNK2信号通路在游离脂肪酸诱导肝细胞自噬活性升高的过程中发挥主要作用。抑制自噬促进了脂肪酸诱导的肝细胞凋亡,提示其在脂肪酸诱导肝细胞损伤过程中可能发挥保护作用。本实验为深入认识高脂饮食诱导的肝损伤中自噬的作用及调控机制提供一定的实验依据。