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PLZF调控肺鳞癌和腺癌细胞凋亡的机制研究

汪雷  
【摘要】:早幼粒细胞白血病锌指蛋白(promyelocytic leukaemia zinc finger, PLZF),亦称为ZBTB16(zinc finger and BTB domain containing 16),作为一种转录抑制因子,具有参与调控细胞周期、增殖、分化和凋亡等多种功能。研究表明,PLZF表达下调所引起的细胞凋亡失控与粒系白血病以及前列腺癌、恶性黑色素瘤等实体瘤的发生和发展密切相关。但目前有关该基因在肺癌发生和发展中的作用尚未见文献报道。我们在前期通过基因芯片对5例非小细胞肺癌组织及其对应癌旁组织基因表达谱进行比较发现,肺癌组织中PLZF mRNA表达水平较癌旁组织明显下调。本研究扩大检测样本量,通过定量PCR (Quantitative PCR, Q-PCR)及免疫组化检测进一步发现,PLZF在非小细胞肺癌组织中的表达水平较对应癌旁组织显著下调,其表达水平变化与肿瘤病理类型、原发肿瘤大小及癌细胞凋亡率等存在明显的相关性。在此基础上,我们进一步通过细胞学和小鼠成瘤模型实验探讨了PLZF诱导肺鳞癌和腺癌细胞凋亡发生的机制及其对肺鳞癌和腺癌细胞生长的抑制作用。 第一部分PLZF在非小细胞肺癌中表达与临床病理及凋亡的相关性研究 目的:1、检测非小细胞肺癌及对应癌旁组织中PLZF表达。2、分析PLZF表达水平变化与患者年龄、性别、淋巴结转移、肿瘤大小、临床分期、病理类型及凋亡的关系。 方法:1、抽提119对NSCLC样本(癌组织及其相应癌旁组织)总RNA,反转成cDNA后,采用Q-PCR方法对PLZF的mRNA水平表达进行检测。2、将119对NSCLC样本制成组织芯片,用免疫组化的方法(两步法)检测PLZF蛋白在NSCLC样本中的表达。结果的判定方法:阳性信号呈棕黄色或棕黑色颗粒状,主要位于细胞核内。根据肿瘤细胞染色程度分为4级:0(无着色),1(浅度染色),2(较深染色),3(深度染色);再根据肿瘤细胞着色范围(阳性细胞占肿瘤细胞的百分比)分为4级:0(0~25%着色),1(26~50%着色),2(51~75%着色),3(76~100%着色)。两者乘积为最终结果,癌组织评分等于其对照组织为表达正常,低于其对照组织为表达下调。3、运用TUNEL法检测NSCLC样本的凋亡指数,凋亡指数定义为每张切片取5个高倍镜视野(×400),每个视野计数100个所需检测的细胞,计算凋亡细胞在500个细胞中比值。4、分析PLZF表达异常和临床病理及凋亡的相关性。 结果:1、在所有119对NSCLC样本中,PLZF在mRNA水平及相应蛋白水平的表达变化趋势均一致,其中103例(86.6%)非小细胞肺癌组织中PLZF表达水平显著低于对应癌旁组织。2. PLZF的表达水平变化与患者年龄、性别、淋巴结侵袭、临床分期在统计学上无显著差异,但与原发肿瘤大小和病理类型显著相关。3、PLZF下调表达的肺鳞癌和腺癌组织凋亡指数较对应癌旁组织凋亡指数的下降程度显著高于PLZF表达正常的肺鳞癌和腺癌组织。 结论:1、PLZF异常表达不仅参与肺癌发生,还参与肺癌发展。2、PLZF可能促进肺鳞癌和腺癌细胞凋亡。 第二部分PLZF调控肺鳞癌及腺癌细胞凋亡的途径研究 目的:1、以人肺鳞癌和腺癌细胞株为研究对象验证PLZF促体外细胞凋亡的功能。2、阐明PLZF调控肺鳞癌和腺癌细胞凋亡的机制。 方法:1、PLZF表达质粒分别转染A549,Calu-3、H226和H520等肺癌细胞株,AnnexinV/PI双染色后通过流式细胞仪检测PLZF表达质粒转染组、空载体转染组和未转染组细胞凋亡情况,FITC-/PI-染色细胞为正常细胞,FITC+/PI-染色细胞为早期凋亡细胞,FITC+/PI+染色细胞为晚期凋亡细胞,FITC-/PI+染色为坏死细胞。2、分别通过Q-PCR及Western blot方法检测PLZF质粒转染组和其他两组细胞凋亡通路关键因子Fas、FasL、Bax、Bcl-2、caspase-3、8、9、XIAP及Survivin的mRNA和蛋白表达水平。3、挑选凋亡抑制基因作为假设靶基因,克隆其启动子连接DeRed红荧光蛋白开放阅读框构建重组报告质粒,与PLZF表达质粒共转染后观察PLZF对假设靶基因启动子的调控作用。 结果:1、流式细胞仪检测发现转染PLZF表达质粒24小时后细胞凋亡明显多于空载体转染组和未转染组,随着时间增加,PLZF质粒转染组细胞凋亡率显著增加。2、Q-PCR及Western blot结果表明:PLZF表达在转染72小时后达到高峰,PLZF质粒转染组的Bax、Fas、caspase-3、8、9等凋亡相关基因表达显著高于空载体转染组和未转染组,Survivin、FasL和XIAP表达无显著差异,Bcl-2表达则显著低于其他两组。3、报告基因检测显示PLZF在转录水平上抑制Bcl-2的表达。 结论:1、PLZF具有促进肺鳞癌和腺癌细胞凋亡的功能。2、PLZF可能主要通过抑制Bcl-2表达激活线粒体凋亡通路的方式调控肺鳞癌和腺癌细胞的凋亡。3、PLZF同时具有激活死亡受体Fas/FasL通路诱导肺鳞癌和腺癌细胞凋亡的功能,但具体机制仍有待进一步研究。 第三部分PLZF调控肺鳞癌及腺癌细胞体内凋亡及增殖的实验研究 目的:通过腺病毒介导的转基因方法研究PLZF高表达对肺鳞癌及腺癌细胞体内凋亡及增殖能力的影响,探讨其作为肺鳞癌及腺癌基因治疗靶点的可行性。 方法:1、构建表达PLZF的重组腺病毒Ad.PLZF。2、以人肺鳞癌细胞株H226、H520及肺腺癌细胞株A549、Calu-3为研究对象,Ad.PLZF转染肺鳞癌和腺癌细胞后,通过测定细胞周期及细胞倍增时间明确PLZF高表达对体外细胞增殖活性的影响。3、制作小鼠移植瘤模型(皮下接种2×107个癌细胞),根据瘤体内注射物不同分为3组:Ad.PLZF组,Ad.GFP组和PBS组,通过计算相同时间各组瘤体体积、质量比较各组间肺鳞癌和腺癌细胞体内生长情况,并通过瘤体组织切片检测PCNA阳性细胞率和凋亡指数(TUNEL法)了解肿瘤细胞体内增殖及凋亡情况。 结果:1、成功构建了重组腺病毒Ad.PLZF。2、Ad.PLZF转染组肺鳞癌及腺癌细胞的倍增时间显著延长,增殖指数显著降低。3、异种移植瘤体内注射重组腺病毒Ad.PLZF组的小鼠移植瘤体积及质量均显著低于对照组。4、瘤体组织切片检测结果表明Ad.PLZF组癌细胞的增殖能力显著下降,凋亡指数显著升高。 结论:PLZF能抑制肺鳞癌和腺癌细胞的增殖并促进癌细胞凋亡,可能是肺鳞癌及腺癌基因治疗的潜在有效靶点。


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