收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

共培养诱导骨髓间充质干细胞向leydig细胞分化的研究

周英晋  
【摘要】:研究背景 随着环境污染、人口老龄化的日益加重,雄激素缺乏性疾病的发病率具有逐年上升的趋势,雄激素的缺乏不但严重影响患者身体健康如男性第二性征异常、造成生理功能紊乱,且严重影响男性的心理健康,容易造成社会问题[1、2]。 针对这类疾病,传统上的治疗主要靠外源性的雄性激素补充或替代,但由于外源性雄激素补充无法接受垂体-性腺轴的生理调节,易造成体内激素失调失调,且抑制体内的正常雄性激素的分泌,长期使用常会引起高血压、红细胞增多、骨密度异常等一系列严重并发症[2]。与之相比,Leydig细胞移植,可接受下丘脑-垂体-性腺轴的调节,符合人的生理规律,具有明显优势,是治疗雄激素缺乏性疾病的可靠、理想的治疗途径[5]。随着组织工程技术的发展,采用组织工程技术以Leydig细胞作为种子细胞,重建具有正常生理功能和形态的组织,则有望在形态、功能两个方面解决睾丸缺失/雄激素缺乏性疾病,为该类疾病的治疗提供更符合生理的治疗途径[4]。 虽然Leydig细胞治疗具有明显的优势,但细胞来源不足和免疫排斥问题是制约该技术发展的主要瓶颈。Leydig细胞仅存于睾丸,数量有限(仅占睾丸细胞总量的2-5%),普遍依靠同种异体供应,存在免疫排斥问题,临床广泛应用受到极大限制[5]。 来源于自体骨髓组织或脂肪组织的间充质干细胞,取材方便,通过体外分离、培养及富集,可获得大量的细胞,如果能将其诱导成leydig细胞,则可以同时解决leydig细胞移植的来源及免疫排斥两个问题。普遍认为,性腺及肾上腺等类固醇合成器官从来源于中段中胚层的肾上腺生殖器原基发育而来[6],而Leydig细胞来源于胚胎发育期的中肾胚的间质细胞,并认为位于管周的成纤维样细胞为leydig干细胞或前体细胞,leydig细胞由这些细胞分化而来[7]。间充质干细胞(mesenchymal Stem Cells,MSCs)与leydig干细胞都来源于中胚层,因而具有向Leydig细胞转化的理论可能[8]。普遍认为类固醇因子-1(steroidogenic factor 1, SF-1)是睾丸及肾上腺发育及类固醇激素合成的关键的核内受体,在它的调控下,类固醇合成酶的各个基因得以表达[6]。Tomoko Tanaka在2006年用骨髓基质细胞注入发育期的大鼠睾丸内,这些细胞表现出与leydig细胞相似的特性;同时将携带绿色荧光蛋白的P450scc用腺病毒携带AD/4Bp基因后转染体外分离小鼠BMSCs,并在加入cAMP培养液中培养2周后,这些细胞表现出leydig细胞的特性,并能分泌睾酮[8]。Gondo等在2008年用这种方法处理BMSCs及脂肪干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, AMSCs)后,发现BMSCs向产生睾酮的leydig细胞方向分化,而AMSCs则倾向于产生糖皮质类激素的肾上腺细胞分化[6]。Takashi2009年将肝受体同系物-1(liver receptor homolog-1,LRH)以质粒转染人的BMSCs及cAMP处理后,这些细胞表达肾上腺及睾酮合成的基因[9]。该类实验表明BMSCs在异位表达的SF-1的刺激下可以向leydig细胞方向转化,转录并表达睾酮合成过程中所需的各种酶,并具有睾酮分泌功能。该类实验主要用于研究性腺器官的发育,由于腺病毒转染的潜在安全问题,诱导后的细胞在临床治疗中的意义不大,同时说明在诱导分化为leydig细胞上BMSCs比ADSCs更适合。 另外的研究主要是利用leydig细胞在体内生长的微环境在也可将BMSCs诱导向leydig细胞方向分化。Takashi Yazawa及Tomoko Tanaka等将大鼠BMSCs注射入3周龄发育期大鼠睾丸,结果显示注射的部分BMSCs能向Leydig细胞分化,并表达leydig细胞的各种细胞标志物[8、10]。YanHe Lue等进一步探讨了BMSCs注射入睾丸的曲精小管及睾丸间质的分化结局,绿色荧光蛋白标记的BMSCs分别注射入正常leydig细胞的大鼠及c-kit基因沉默的W/Wv大鼠(睾丸发育缺陷,无法形成精原细胞)睾丸内,10-12周后注射入正常大鼠的睾丸内BMSCs根据邻近细胞的情况,依次分化为与邻近细胞相识的Leydig细胞、Sertoli细胞、生殖细胞系细胞等体细胞成分,而注射入睾丸发育畸形鼠体内的BMSCs未发生分化。虽该然不能完全排除细胞融合的可能,但是可以说明睾丸各种细胞生长的微环境对移植BMSCs的定向分化具有诱导作用[11]。 上述研究成果显示BMSCs诱导分化成为Leydig细胞具有可行性,但距临床应用仍有差距。基因转染技术虽然有望在体外大量的诱导BMSCs分化为雄激素分泌细胞,但该方法必须克服腺病毒转染技术带来的生物安全性问题,目前尚属世界性难题。BMSCs睾丸内注射属实验性研究,要求受体动物在发育期,对于Leydig细胞功能不足或不存在睾丸的受体意义不大,且分化的效率不高,目前通过该途径很难获得大量的自体BMSCs分化的Leydig细胞。然而,以上研究成果提示,虽然目前对睾丸分化微环境促进BMSCs定向分化的始动因素并不明确,但通过体外模拟Leydig细胞生长的微环境,在体外实现BMSCs向Leydig细胞大量的定向分化具备理论可能性。 综上所述,针对Leydig细胞治疗及雄激素分泌组织构建研究中关键的种子细胞来源问题,结合本课题组前期实验中,通过差速贴壁法可以大量获得较纯的leydig细胞的基础上,将骨髓间充质干细胞与Leydig细胞共培养,利用leydig细胞生长的微环境及分泌的可溶性因子诱导BMSCs向Leydig细胞分化,以解决种子细胞来源不足的难题。该项研究可为临床雄性激素缺乏症提供一条安全有效的途径,同时对于进一步研究胚胎发育过程中leydig干细胞具体分化过程中的各种细胞因子的作用及调控机制具有借鉴意义。 研究目的 本研究从骨髓基质干细胞开始,通过Ficoll液分离、贴壁、增殖并传代,富集足够的BMSCs,并经过诱导分化成骨、成脂肪鉴定BMSC的多向分化能力;通过差速贴壁法获得的大鼠睾丸leydig细胞的免疫组化分析,证实差速贴壁法可以获得较纯的大鼠睾丸leydig细胞;探索共培养体系对BMSC向leydig细胞诱导的可能性,并对诱导后的BMSC进行leydig细胞的各项特异性指标进行免疫组化、RT-PCR的测定,检验诱导的BMSC作为雄激素分泌组织种子细胞的可行性,为解决组织工程化雄激素分泌组织研究中种子细胞来源不足的问题提供有效手段。 研究方法 一、密度梯度离心法获得骨髓基质干细胞及鉴定: 3周龄大鼠的股骨、胫骨,10ml注射器冲洗,1.083g/ml的ficoll去除血细胞,2天后半量换液,4天后首次全部换液,获取的贴壁细胞,并传代培养。取第三代BMSC进行成骨、成脂肪分化诱导。同时观察细胞形态,克隆样集落形成,并检测细胞增殖情况。 二、差速贴壁法分离纯化3周鼠龄大鼠Leydig细胞:取3周龄雄性Wister大鼠双侧睾丸,无菌下去除白膜及较大的血管,用胶原酶震荡消化和400目(Ф33μm)不锈钢滤网过滤,离心后贴壁培养2小时,弃上清并漂洗3次,加入3%FBS的DMEM/F12培养液培养。 三、共培养体系对BMSC诱导分化作用:3周龄大鼠睾丸leydig分离后以transwell培养皿双层间接共培养体系进行培养,隔1-2天换液,2周、4周后对诱导的细胞3β-HSD、LHR免疫化学染色、免疫荧光染色,PCR检测stAR、3β-HSD及LHR的表达情况及睾酮分泌水平的测定。 研究结果 第一部分梯度密度离心法获得骨髓基质干细胞及鉴定通过剥离股骨、胫骨,10ml注射器冲洗洗骨髓,1.083g/ml的Ficoll液去除红细胞,离心后用10%小牛血清的低糖DMEM培养液接种,贴壁4天后首次全量换液,可以获取的数量不等的贴壁细胞,并形成克隆集落样生长,传代培养后细胞形态、生长能力无明显变化,3天后即可观察到可见BMSC呈的克隆集落样生长,在体外培养条件下可以传至6-7代。取第三代的BMSC可以诱导向成骨、成脂肪分化,说明获得的BMSCs具备很强的增殖能力,并多向诱导分化,可用于下一步研究。 第二部分差速贴壁法获得的LC细胞成分分析 采用差速贴壁法能够获得3周龄大鼠睾丸LC细胞,经3β-HSD、LHR免疫化学染色分析,结果显示在DMEM/F12培养体系内培养1天后,几乎所有的细胞都表达3β-HSD、LHR抗体,提示我们该方法能有效对leydig细胞进行分离、富集。 第三部分leydig细胞与BMSCs的共培养体系对BMSC诱导分化作用的研究通过3周鼠龄的leydig细胞与BMSCs间接共培养2周、4周后,免疫组化、PCR分析鉴定共培养的BMSCs情况,免疫组化显示部分BMSC表达leydig细胞特异性标志物3β-HSD、LHR, RT-PCR反应检测到leydig细胞的部分特异性标志物stAR、3β-HSD及LHR的mRNA表达,说明在间接共培养条件下BMSC可以向leydig样细胞分化。 研究结论 本研究证实差速贴壁法能够有效获得大鼠睾丸Leydig系细胞的各级细胞成分,通过间接共培养体系,能够诱导骨髓间质干细胞向leydig样细胞方向上分化,并表达leydig细胞的特异性标志物。我们推测通过进一步分析leydig细胞分化的始动因素及leydig细胞分化过程中的各种所需的各种营养因子,优化实验培养条件将可能诱导BMSCs分化为成熟的leydig细胞,为临床上雄性激素缺乏性疾病提供一条理想的治疗途径。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 杨军;杨琴;贾延劼;李傲;曾志磊;谢鹏;任俊伟;;相互间非接触性共培养对神经干细胞和骨髓基质细胞的影响[J];南方医科大学学报;2010年04期
2 韦玉军;周建丽;郑震寰;龚锴;王爱军;敖强;公衍道;张秀芳;;体外共培养诱导脂肪来源干细胞分化为Schwann-like cell的方法研究[J];生物物理学报;2009年S1期
3 韩翠萍;刘吉勇;高蕾;张晓华;裴庆山;孙欣欣;;人脐血间充质干细胞向类肝细胞分化 人肝细胞共培养诱导法的可行性?[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年01期
4 朱艳霞;刘天庆;宋克东;马学虎;崔占峰;;心肌样微环境诱导脂肪干细胞分化的研究[J];生物化学与生物物理进展;2009年05期
5 欧念文;陆东风;杨镇军;胡德喜;;新生小鼠心肌干细胞与心肌细胞共培养诱导分化试验[J];血栓与止血学;2010年01期
6 谢雪微;杨洁;陈娟;刘娜;曾文高;唐洲平;王伟;;嗅鞘细胞微环境和水凝胶生物支架对脂肪干细胞成嗅鞘样细胞分化的影响[J];华中科技大学学报(医学版);2010年02期
7 李全修;陈伯华;刘勇;徐陵;;构建兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的体外模型[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年45期
8 徐远;俞兴;徐林;;骨髓间充质干细胞与髓核细胞的体外共培养[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年27期
9 郭嘉宁;雷建园;李奕;畅继武;;体外诱导胎儿骨髓间充质干细胞向胰岛β样分泌细胞的分化[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年19期
10 刘弘光;夏鲲;刘晓玉;庞希宁;;移植骨髓间充质干细胞治疗大鼠糖尿病的研究[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2007年01期
11 周进;田国萍;王静娥;徐冰;李莉;朱峰;韩建;胡凤杰;;脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞的体外分化能力[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年32期
12 夏鹰,江澄川,汪洋,丁忠良,徐斌;雪旺细胞对共培养不同发育阶段纹状体生长的影响[J];中华实验外科杂志;2005年09期
13 邱匀峰;吴小涛;赵梓汝;王运涛;;骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养的实验研究[J];东南大学学报(医学版);2007年04期
14 郑玉萍;冯朝晖;张璐琰;佘华宁;王肖华;熊全臣;;小鼠视网膜神经细胞在不同培养模式中的形态表现[J];国际眼科杂志;2008年11期
15 李卫东;张晓刚;常静;蒋芳萍;;与心肌细胞共培养的小鼠胚胎干细胞向心肌样细胞分化[J];基础医学与临床;2009年01期
16 金玉玲;刘锲;刘静静;李欣;王丽华;;小胶质细胞对体外培养神经干细胞向胆碱能神经元分化的影响[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年23期
17 赖纯米;张杰;吴庆;李克勇;周志俊;常秀丽;;镉致大鼠前体精原干细胞-支持细胞共培养系损伤的形态变化[J];环境与职业医学;2010年05期
18 孙慧环;刘福强;龚蕾;肖芳;侯新国;孙宇;宋君;陈丽;王旭平;;骨髓间充质干细胞对INS-1细胞凋亡的影响[J];山东大学学报(医学版);2011年05期
19 陈洁,高杰英,曾丽玲,徐鹏辉,钟耀华,陈小章;Peyer’s结淋巴细胞对结肠上皮细胞屏障功能的影响[J];自然科学进展;2003年03期
20 张良,唐仕波,张淳,黄冰,罗燕,陈系古;视黄酸联合视网膜细胞共培养对胚胎干细胞体外分化的诱导作用[J];眼科研究;2004年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 周英晋;邢新;王晓云;周广东;李军辉;毕宏达;肖斌;;共培养诱导骨髓间充质干细胞向leydig细胞分化的研究[A];中华医学会整形外科学分会第十一次全国会议、中国人民解放军整形外科学专业委员会学术交流会、中国中西医结合学会医学美容专业委员会全国会议论文集[C];2011年
2 郑学栋;徐国兴;;联合共培养系统诱导骨髓间充质干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的研究[A];第十届全国中西医结合眼科学术会议暨第五届海峡眼科学术交流会论文汇编[C];2011年
3 曾俊义;魏云峰;汪泱;谢安;娄远蕾;张梅;应国秋;徐信群;;间接接触共培养下骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞及相关调控基因的时序表达[A];第一届全国中西医结合心血管病中青年医师论坛论文汇编[C];2008年
4 王少沛;李卓佳;曹煜成;陈素文;杨莺莺;;微绿球藻、隐藻、颤藻的种间竞争关系[A];2007年中国水产学会学术年会暨水产微生态调控技术论坛论文摘要汇编[C];2007年
5 宋明宝;于学军;朱光旭;;双层共培养模型中内皮细胞对平滑肌细胞增殖能力的影响[A];中华医学会第11次心血管病学术会议论文摘要集[C];2009年
6 王春婷;杨浩;鞠躬;;嗅神经鞘细胞对神经突起体外生长的作用[A];中国神经科学学会第六届学术会议暨学会成立十周年庆祝大会论文摘要汇编[C];2005年
7 张岩;罗奋华;吴应积;;大鼠曲细精管生殖细胞共培养和精子发生过程的观察[A];第一届中华医学会生殖医学分会、中国动物学会生殖生物学分会联合年会论文汇编[C];2007年
8 方艳芬;林美花;周星露;朱琼文;杨波;何俏军;;泛素-蛋白酶体系统参与的周期调节在全反式维甲酸(ATRA)诱导的白血病细胞分化过程中的作用研究[A];2009医学前沿论坛暨第十一届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2009年
9 何国雄;李飞;李海标;梁志忠;潘志信;利玉欢;黄锦桃;;移植成人骨髓间质干细胞在脑梗死模型鼠的分化及功能恢复研究[A];第九次全国神经病学学术大会论文汇编[C];2006年
10 高毅;慕宁;唐力军;;体外诱导人骨髓多能成体祖细胞向肝样细胞分化的实验研究[A];肝脏病防治学术研讨会及新进展学习班专刊[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 周英晋;共培养诱导骨髓间充质干细胞向leydig细胞分化的研究[D];第二军医大学;2011年
2 顾劲扬;骨髓间充质干细胞与肝细胞共培养的实验研究[D];南京医科大学;2009年
3 何勇;催产素诱导下3D共培养促进ESC定向分化为CM的研究[D];第四军医大学;2010年
4 吴江群;骨髓基质干细胞体内成骨分化研究[D];中国协和医科大学;2008年
5 王平;经门静脉肝脏内骨髓间充质干细胞移植的实验研究[D];复旦大学;2005年
6 赵冰海;全氟辛烷磺酸等环境污染物染毒哺乳期大鼠对成年期Leydig细胞影响的实验研究[D];吉林大学;2010年
7 常青;软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养构建组织工程软骨的最佳比例[D];南京医科大学;2011年
8 杨杰;诱导人乳腺脂肪来源干细胞向乳腺上皮样细胞分化的实验研究[D];华中科技大学;2012年
9 晏丽;甲基转移酶抑制剂AdOx对细胞多能性相关基因调控的研究[D];北京协和医学院;2011年
10 解杰;体外藻酸钙模拟前列腺癌骨转移三维立体模型的构建[D];华中科技大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 杨文飞;共培养法诱导骨髓间充质干细胞向毛细胞样细胞分化的实验研究[D];福建医科大学;2011年
2 郑丽娜;仿生电刺激在心肌细胞诱导胚胎干细胞向心肌样细胞分化中作用的研究[D];重庆医科大学;2009年
3 欧念文;新生小鼠心肌干细胞与心肌细胞共培养诱导分化研究[D];广州医学院;2009年
4 王爱红;人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的初步研究[D];汕头大学;2008年
5 王秀娇;嗅鞘细胞对神经干细胞增殖及向胆碱能神经元分化的实验研究[D];佳木斯大学;2010年
6 陈珊珊;OECs、SCs对NSCs、BMSCs、HSCs存活、增殖、分化及神经营养因子表达的影响[D];昆明医学院;2011年
7 冯月兰;视网膜色素上皮细胞培养上清液联合视黄酸对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用[D];福建医科大学;2009年
8 代媛媛;与牙周膜成纤维细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞分化的影响[D];第四军医大学;2010年
9 李晋;雪旺氏细胞共培养对成肌细胞基因表达谱的影响[D];南方医科大学;2009年
10 段修芳;体外诱导BMP7基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞向肾小管上皮样细胞分化的实验研究[D];南昌大学;2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 施嘉奇 通讯员 王姿英;探索中药对干细胞分化的作用[N];文汇报;2009年
2 王姿英;中英合作中药调控干细胞分化研究启动[N];中国医药报;2009年
3 陈超;科学家发现引发细胞分化的分子通道[N];科技日报;2010年
4 记者 毛黎 冯卫东;美开发出使干细胞分化成肌肉的基因开关[N];科技日报;2009年
5 冯蕾;近三年培养新技师60多万人[N];光明日报;2007年
6 张佳星;分化之路 殊途同归[N];科技日报;2008年
7 岳阳;我国学者初建HIF-1α介导白血病细胞分化新理论[N];中国医药报;2006年
8 张佳星;干细胞分化路径存在差异性[N];中国矿业报;2008年
9 记者 韩有存;临洮切实加强乡土人才队伍建设[N];定西日报;2008年
10 本报记者 刘垠;中国干细胞研究应向大动物实验平台挺进[N];大众科技报;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978